用于数字DNA扩增的集成化多功能液滴微流控平台开发

近年来，肿瘤早期诊断研究已经取得了显著进展。其中核酸标记物在液体活检中发挥着关键作用，能够提供关于治疗响应、肿瘤复发以及肿瘤内异质性等方面的重要信息。数字DNA扩增技术作为一种可靠且准确的液体活检工具，能够在不依赖标准参考物的情况下对微量核酸分子进行绝对定量。为了实现数字DNA扩增的单分子分辨率，需要将检测样本分隔到系统内的独立区室进行扩增，并通过计数和分析阳性区室的数量和荧光强度来确定目标基因的拷贝数。

目前，数字PCR中的分区实现主要依赖于基于腔室的微流控技术和基于液滴的微流控技术。基于腔室的方法通过泵或阀门将样本引入数万个反应腔室的阵列中。而基于液滴的方法则通过注射泵、离心力或气动力生成反应腔室，从而可以创建理论上无限数量的腔室，提供了更高的灵活性和更广的动态范围，以提高检测能力。然而，现有的数字PCR仪往往依赖于昂贵的商业系统或专用设备，导致成本居高不下。此外，检测过程中需要在不同设备之间进行转换，存在交叉污染的风险，并且液滴损失可能导致目标定量低估。

因此，无论是市场还是临床，都迫切需要一种集成化的微流控平台，以满足数字DNA扩增在液体活检中的用户需求，推动液体活检在癌症诊疗中的广泛应用，并为个性化医疗和治疗监测提供更可靠的工具。该平台应具备独立区室进行扩增的能力，并能够通过计数和分析阳性区室的数量和荧光强度来确定目标基因的拷贝数。同时，该平台应减少操作过程中交叉污染的风险和液滴损失导致的目标定量低估。此外，该平台应具备较高的灵活性和更广的动态范围，以适应不同的检测需求。

为实现上述目标，近期，香港城市大学生物医学系、香港大学临床肿瘤学系、晶准医学的联合科研团队发表了一篇利用集成化多功能的液滴微流控技术平台实现数字DNA扩增的研究文章，提供了一种快速高效的数字DNA扩增解决方案。相关研究内容以“An integrated and multi-functional droplet-based microfluidic platform for digital DNA amplification”为题发表在国际权威杂志Biosensors and Bioelectronic上。

高集成多功能微流控芯片的设计

首先，为了实现一个高度集成和多功能的微流控平台，研究团队设计了一种特殊的芯片结构，如图1所示。该芯片结构包括连续相（油）的进口、水相（样品）的进口、用于生成液滴的流动聚焦结构、树状结构分割通道，以及用于原位扩增和检测的收集室。这种设计不仅能实现高通量的液滴生成，还能保证反应过程的一体化。

特别需要注意的是，为了克服PDMS材料的多孔性以及透气性带来的挑战，研究团队采用了三明治的芯片结构制造方法。底部玻璃载板用于支撑芯片，PDMS芯片用于液滴的生成和扩增发生以及信号检测，并添加了硅油进行预饱和，以防止液滴的蒸发。顶部的玻璃盖片则能够有效防止样品在热循环过程中的蒸发和损失。

此外，研究团队巧妙地设计了鲁尔接头拼接，以提供方便的样品装载和压力控制，并在接头内部设置油相储备以提供密封保护。这种设计方法不仅有效地克服了PDMS材料多孔性导致的液滴蒸发挑战，还确保了扩增信号的一体化检测。同时，所采用的低成本制造方法也易于实施。

图1 基于液滴的数字DNA扩增的全集成多功能平台示意图

微液滴生成及稳定性优化

液滴的大小、形状和均一性对于高通量操作至关重要。为了提高液滴生成的通量和效率，研究团队设计了一种树状结构分割通道，通过将大液滴等分为两个较小的液滴，并通过分割角度和控制连续相和分散相的流速比，实现了对液滴尺寸的精确均一控制，使得该芯片设计在稳定性和功能性方面表现出色，能够实现对液滴的精确控制，为后续实验提供可靠的基础。

为了保持液滴的稳定性，在热循环过程中，研究团队采取了一系列优化设计。首先，通过硅油预饱和PDMS，避免了油相在热循环中的吸收。其次，通过对不同浓度的表面活性剂的测试优化，实现了液滴在热循环过程中的稳定，并且对DNA扩增的性能影响较小。

综上所述，通过改进和验证，研究团队实现了微流控系统中液滴生成和稳定性的提升。在扩增热循环后，超过90%的液滴保持了其原始形状和状态，表明该技术平台在液滴的稳定性方面具有良好效果。

图2 微流控系统中液滴生成和稳定性的优化与验证示意图

目标分子检测验证

最后，研究团队使用数字PCR（dPCR）和数字LAMP（dLAMP），针对两种突变进行了检测：EGFR外显子20突变和HPV-16突变验证了该技术平台在DNA扩增中的可行性。EGFR外显子20基因突变在非小细胞肺癌（NSCLC）患者中约占5% ~ 10％，而HPV感染是宫颈癌的主要原因，其中HPV-16是最常见的高危型，准确检测对于指导治疗以及改善预后至关重要。图3结果显示，通过数字PCR和数字LAMP，在扩增后，含有目标分子的液滴显示出比其他液滴更高的荧光信号，表明目标分子的有效扩增。通过计算正荧光信号和负荧光信号的液滴数量，确定样品的浓度。研究人员还使用了一定的阈值来排除扩增后由于液滴聚集而形成的大液滴。研究结果显示，测量值与预期值之间呈现出线性、统计显著的相关性。通过Poisson统计，测量值与预期值之间得到很好的匹配。

研究人员还将开发的平台的结果与商业平台的结果进行了比较，发现两者之间存在高度一致性，这表明该平台作为数字DNA扩增的可行替代品具有准确性和可靠性。

图3 集成化多功能的平台在DNA扩增中的表现示意图

综上所述，在这项研究中，研究团队成功开发出一款多功能的、易于操作的基于液滴的微流控平台，用于进行数字DNA扩增，可用于数字PCR技术平台。该技术将液滴制备、扩增及荧光信号检测进行了集成，从而克服了现有方法的局限性。这一改进不仅简化了工作流程，还在微制造方面降低了成本。该平台易于制造和操作，适用于广泛的用户，进一步增加了其实用性。

此平台实现了高通量的微液滴生成，能在5分钟内将40 μL样品分配到超过50,000个均匀大小的微滴中（变异性< 2%）。包含目标分子的微液滴在扩增循环过程中表现出良好的稳定性，并且能够稳定信号一段时间用于后续检测。该平台展示了处理多种目标和扩增方法的能力和可行性。

在对等温和PCR的核酸定量方面，该平台表现出了高灵敏度和准确性，显示出巨大的潜力。该平台有望通过帮助识别更多符合靶向治疗条件的突变患者，并提供非侵入性监测方法，对个体化医学产生重大影响，并改善患者护理。此项工作具有创新性和重要意义，为未来的研究和临床应用奠定了坚实基础。







审核编辑：刘清