基于微流控芯片的代表性关键技术

描述

临床医学全面走向个性化医疗诊疗是当今医学发展的一大方向,精准的体外诊断技术是正确诊疗的基本保证。而体外诊断基本主要是基于体液(血液,尿液,唾液)的分析,对于这些体液的操控, 自动化肯定是个大趋势。

那么对于液体的自动化操控,正是我们微流控要干的事情。所以,体外诊断(IVD)里除去试剂的研发,后续的自动化检测, 基本避不开微流控。这就是微流控技术必将火起来的基础。

微流控技术

微流控(microfluidics)是一种精确控制和操控微尺度流体, 以在微纳米尺度空间中对流体进行操控为主要特征的科学技术,具有将生物、化学等实验室的基本功能诸如样品制备、反应、分离和检测等缩微到一个几平方厘米芯片上的能力,其基本特征和最大优势是多种单元技术在整体可控的微小平台上灵活组合、规模集成。是一个涉及了工程学、物理学、化学、微加工和生物工程等领域的交叉学科。

芯片

微流控技术是MEMS技术在流体处理方面的一个重要分支,由于这一技术是生物芯片的基石,2003年被福布斯(Forbes)杂志评为影响人类未来15件最重要的发明之一。

微流控芯片

微流控芯片(MicrofluidicChip) ,又称为芯片实验室(Lab-on-a-Chip)或生物 芯片。是利用MEMS技术将一个大型实验室系统缩微在一个玻璃或塑料基板上,从而复制复杂的生物学和化学反应全过程,快速自动地完成实验。其特征是在微米级尺度构造出容纳流体的通道、反应室和其它功能 部件,操控微米体积的流体在微小空间中的运动过程,从而构建完整的化学或生物实验室。

这一技术将给基因、免疫、微生物和临床化学等诊断领域带来颠覆性突破,使威胁人类健康的诸多疾病如癌症、心脑血管疾病的早期诊断和预防成为可能。生物芯片与生物靶向药物的结合,推动临床医学全面走向个性化医疗诊疗。

随着微流控芯片技术的逐渐展开及微分析技术的需求,芯片构型设计越加丰富,出现了一系列形式各异、具有多种微通道网络结构的芯片构型。如电泳芯片分离通道的网络形状主要有:直线型、螺旋型、弯曲蛇形、多边形、折叠形等。由于生化分析的复杂性和多样性需求,微流控芯片技术的发展趋于组合化和集成化,经常需在一块芯片基片上集成多种功能单元,如化学反应器、生物反应器、过滤装置等以进行多种样品的分析检测,以用于DNA测序和突变点检测,氨基酸、蛋白质、细胞检测和药物筛选等。

基于高通量快速分离的需要,多通道阵列并行操作是微流控芯片的发展趋势,芯片通道数量已从最初的12通道、96通道,发展到384通道。

微流控芯片的制备

微流控芯片通过微细加工技术集成各种不同功能的单元,如微反应池、微泵、微阀、检测单元等。微通道加工技术与以硅材料二维和浅深度加工为主的集成电路芯片不同。微流控芯片微通道的两个重要指标是深宽比和微通道界面形状。

深宽比指在基片上形成的微结构的深度特征与宽度特征之比,高深宽比结构加工难度较大。对于直接加工法,形状特征与腐蚀的方向性有关,即各向同性或各向异性会形成不同的几何形貌特征;对于复制加工方法,如热模压和模塑法等,微通道几何形状直接与模板形状及加工工艺有关。

1、微流控芯片的材料

微流控芯片结构设计选取材料时考虑的主要因素是:

① 优良的加工性能,便于大批量生产以降低费用。 

② 生物相容性或化学惰性,不影响分析试剂、药物的化学性质;

③ 散热和绝缘性;

④ 良好的光透性能,适应光学检测的要求。

另外还要考虑材料的电渗流特性、表面可修饰性及可密封性能等。

到目前为止,制作微流控芯片的材料主要有:硅、玻璃、石英、高聚物、陶瓷、纸等。选择合适的材料对于制作工艺选择和微流控芯片的成功应用非常重要。

(1) 硅材料

单晶硅是最先尝试使用的芯片基材。硅及二氧化硅具有良好的化学惰性和热稳定性,而且硅的微细加工技术已趋成熟。即使复杂的三维结构,也可用整体和表面微加工技术进行高精度的复制。

硅材料的缺点在于易碎、成本高、不透光、电绝缘性差且表面化学行为复杂等,虽然较厚的氧化层(>15 μm)可以提高其绝缘层,但厚氧化层尚无成熟的键合方法。上述缺点限制了硅材料在微流控芯片中的广泛应用。但由于硅和聚合物材料间的粘附系数小,故现常用来制作聚合物微通道芯片时所用到的模具。

(2) 玻璃

玻璃和石英弥补了单晶硅在电学和光学方面的不足,价廉、易得,具有良好的电渗性和良好的光学性质,为微系统的故障诊断和光学检测提供了便利条件;  然而,玻璃和石英微流控芯片存在着制作工艺复杂,加工成本过高.

而且使用玻璃和石英作基体材料时,通常使用各向同性腐蚀技术,很难获得高深宽比的微结构,深度刻蚀困难,键合温度高和键合成品率低,使芯片性能难以改善,且需要相应的洁净条件和制作设备,工艺过程复杂。 

要想制作对液体操控所必需的微泵和微阀是非常困难的。这些都限制了玻璃微芯片的普及化和深度产业化。

(3) 高分子聚合物

与硅和玻璃相比,聚合物材料种类多、选择面广、价格便宜,具有良好的绝缘性和透光性,可施加高电场实现快速分离,成型容易、批量生产成本低,易获得高深宽比的微结构,微通道表面一般不需或仅需较少修饰,绝大部分聚合物材料对生物样品或化学样品具有相容性,更适合于一次性使用,具有广阔的应用前景,已引起国内外极大的关注。

用于制作微流控芯片的聚合物主要可分为三类:热塑性聚合物、固化型聚合物和溶剂挥发型聚合物。热塑性聚合物有聚甲基丙烯酸甲酯(PMMA)、聚碳酸酯(PC)和聚乙烯(PE)等;固化型聚合物有聚二甲基硅氧烷(PDMS)、环氧树脂和聚氨酯等;溶剂挥发型聚合物有丙烯酸、橡胶和氟塑料等。其中,常用的有PMMA和PDMS。

PMMA材料具有良好的电绝缘性,可施加高电场进行快速分离。透光性好,成本低,成型容易,可选择多种加工方法,如模压法、注塑法、准分子激光微刻蚀加工等,现已得到了极为广泛的应用。

弹性高分子材料PDMS(又称硅橡胶),具有价格便宜,绝缘性好,无毒;它的透光性好,能透过250 nm以上的紫外光与可见光,易于检测;成型容易,批量生产成本低等优点。但PDMS材料制成的微结构的稳定性较差,疏水性较强,经常需要进行特别处理来进行改进。

选择聚合物做芯片材料时,应根据加工工艺、应用环境及检测方法等诸多因素和聚合物的光电、机械及化学性质选择适用的类型,并注意聚合物材料在所使用的环境下的惰性、电绝缘性、热性能和表面合适的修饰改性方法等。一般应注意以下几个方面的问题:

① 良好的加工性

不同的加工方法对聚合物的加工性有不同的要求。 由于微通道的构型越来越趋于复杂,高深宽比的微通道的优点很多,所以聚合物材料应具有良好的加工性。

② 良好的电绝缘性和热性能

由于微流控芯片中的液体驱动经常采用电驱动方式,而且芯片经常被用于进行电泳分离,加高压电场会产生热量,高温或局部高温都会对分离效果造成影响,所以材料应有良好的电绝缘性和热性能。

③ 良好的光学性质

对于荧光检测和紫外检测而言,材料必须在相应的波长范围内有良好的透光性,才能进行有效的检测。

④ 表面易于修饰改性

聚合物材料的表面易于进行改性,如通过紫外、等离子体、激光和化学处理等,不仅可改变电渗流,而且还可减少样品的的吸附。

⑤ 在使用条件下材料呈化学惰性

由于在微分析操作中经常要接触到各种试剂,需要一定抗溶剂能力和耐酸碱能力,因此,在所采用的分析条件下材料应是惰性的。

⑥ 根据应用场合合理选择

当制作普通微流控芯片时,可选用软化温度较低的材料,如有机玻璃或聚苯乙烯;制作PCR与CE集成芯片时,可选用软化温度较高的材料,如聚碳酸酯或聚丙烯等。

(4)  陶瓷

陶瓷材料易碎、透光性不好,但耐高温,有较高的抗压强度,采用软刻蚀或激光加工可制出微通道,适于极限恶劣条件下使用,如航空、太空试验和极地考察等。

(5) 纸

微流控纸芯片(lab-on-paper,纸上微型实验室)是近几年发展的一种新型微流控芯片。用纸张作为基底代替硅、玻璃、高聚物等材料,通过各种加工技术,在纸上加工出具有一定结构的亲/疏水微细通道网络及相关分析器件。

与传统的硅、玻璃、高聚物微流控芯片相比,微流控纸芯片具有如下优点:

① 成本更低。纸张来源丰富,且其价格远低于硅、玻璃/石英、甚至高聚物等材质;可通过简单的光刻、蜡印、喷墨打印、绘图等方式制作二维纸芯片,或通过简单的折纸或多层纸片叠加的方法制作三维纸芯片,因此纸芯片制作简便,其加工成本远低于传统微流控芯片。

② 分析系统更易微型化、便携化。滤纸本身具有很强的毛细管作用,经图案化疏水性处理即能引导溶液有序流动,因此无需外置的驱动泵;纸张薄,质地轻,且可折叠,因此易于保存和运输。

③ 生物相容性好。滤纸的主要成分为纤维素,具有良好的生物相容性,可以在其表面固定酶、蛋白质和DNA等生物大分子。

④ 检测背景低。纸张通常是白色,有利于在纸芯片上开展比色分析。

⑤ 后处理简单,无污染。纸芯片使用完后,可通过简单安全的燃烧方法进行处理,不会对环境造成污染。

2、微流控芯片的制作技术

(1)光刻和刻蚀技术

传统的用于制作半导体及集成电路芯片的光刻和刻蚀技术,是微流控芯片加工工艺中最基础的。它是用光胶、掩膜和紫外光进行微细加工,工艺成熟,已广泛用于硅、玻璃和石英基片上制作微结构。光刻和刻蚀技术由薄膜沉积、光刻和刻蚀三个工序组成。复杂的微结构可通过多次重复薄膜沉积-光刻-刻蚀这三个工序来完成。

光刻前先要在干净的基片表面覆盖一层薄膜,薄膜的厚度为数埃到几十微米,这一工艺过程称之为薄膜沉积。薄膜按性能不同可分为器件工作区的外延层,限制区域扩张的掩蔽膜,起保护、钝化和绝缘作用的绝缘介质膜,用作电极引线和器件互连的导电金属膜等。膜材料常见有二氧化硅、氮化硅、硼磷硅玻璃、多晶硅、电导金属、光刻抗蚀胶、难熔金属等。制造加工薄膜的主要方法有氧化、化学气相沉积、蒸发、溅射等。

在薄膜表面均匀地覆盖上一层光胶,将掩膜上微流控芯片设计图案通过曝光成像的原理转移到光胶层上的工艺过程称为光刻。光刻技术一般有以下基本工艺过程构成:

①基片的预处理。

通过脱脂、抛光、酸洗、水洗的方法使基片表面净化,确保光刻胶与基片表面有良好的粘附。

②涂胶。

在经过处理的基片表面均匀涂覆一层粘性好、厚度适当的光刻胶。胶膜太薄,易生成针孔,抗蚀能力差;太厚则不易彻底显影,同时会降低分辨率。光刻胶的实际厚度与它的粘度有关,并与甩胶机的旋转速度的平方根成反比。涂胶方法有旋转涂覆法、刷涂法、浸渍法、喷涂法等。

③前烘。

在一定的温度下,使光刻胶液中溶剂挥发,增强光刻胶与基片粘附以及胶膜的耐磨性。前烘的温度和时间由光致抗蚀剂的种类和厚度决定,常采用电热恒温箱、热空气或红外热源。

前烘温度和时间要合适,若温度过高或时间过长会造成显影时留下底膜或感光灵敏度下降,腐蚀时出现小岛;若温度过低或时间过短,会造成显影后针孔增加,或产生浮胶、图形变形等现象。

④曝光。

将已制备好所需芯片图形的光刻掩膜覆盖在基片上,用紫外线等透过掩膜对光刻胶进行选择性照射。受光照射的光刻胶发生化学反应。在实际操作中,曝光时间由光刻膜、胶膜厚度、光源强度以及光源与基片间距决定。曝光的方式有化学曝光、接触式和接近式复印曝光、光学投影成像曝光。

⑤显影。

用光胶配套显影液通过化学方法除去经曝光的光胶(正光胶)或未经曝光的光胶(负光胶),显影液和显影时间的选择对显影效果的影响很大。选择显影液的原则是,对需要去除的那部分胶膜溶解度大、溶解速度快,对需要保留的那部分溶解度小。显影时间视光致抗蚀剂的种类、胶膜厚度、显影液种类、显影温度和操作方法而异。

⑥坚膜。

将显影后的基片进行清洗后在一定温度下烘烤,以彻底除去显影后残留于胶膜中的溶剂或水分,使胶膜与基片紧密粘附,防止胶层脱落,并增强胶膜本身的抗蚀能力。坚膜的温度和时间要合适。

刻蚀是将光胶层上的平面二维图形转移到薄膜上并进而在基片上加工成一定深度微结构的工艺。 

根据刻蚀剂状态不同,可将腐蚀工艺分为湿法刻蚀和干法刻蚀两大类。湿法刻蚀是通过化学刻蚀液和被刻蚀物质间的化学反应将被刻蚀物质剥离下来的刻蚀方法。大多数湿法刻蚀是不容易控制的各向同性腐蚀。

其特点是选择比高、均匀性好、对硅片损伤少,几乎适用于所有的金属、玻璃、塑料等材料。缺点是图形保真度不强,横向腐蚀的同时,往往会出现侧向钻蚀,以致刻蚀图形的最少线宽受到限制。

干法刻蚀指利用高能束与表面薄膜反应,形成挥发性物质,或直接轰击薄膜表面使之被腐蚀的工艺。其最大的特点是能实现各向异性刻蚀,即在纵向的刻蚀速率远大于横向刻蚀的速率,从而保证细小图形转移后的保真性。干法刻蚀的作用基础是等离子体。

用光刻的方法加工微流控芯片时,必须首先制造光刻掩模。掩膜的基本功能是基片受到光束照射时,在图形区和非图形区产生不同的光吸收和透过能力。 用计算机制图系统将掩模图形转化为数据文件,再通过专用接口电路控制图形发生器中的曝光光源、可变光阑、工作台和镜头,在掩模材料上刻出所需的图形。或用微机通过CAD软件将设计微通道的结构图转化为图像文件后,用高分辨率的打印机将图像打印到透明薄膜上。此透明薄膜可作为光刻用的掩模, 基本能满足微流控芯片对掩模的要求。

(2)热压法

热压法(hot embossing)是一种应用较广泛的快速复制电泳微通道的芯片制作技术,适用于PMMA与PC等热塑性聚合物材料。热压法的模具可以是直径在50 μm以下的金属丝或是刻蚀有凸突的微通道骨片阳膜,如镍基阳模、单晶硅阳模、玻璃阳模、微机械加工的金属阳模。 此法可大批量复制,设备简单,操作简便,但所用材料有限。

(3)模塑法

用光刻和刻蚀的方法先制出阳模(所需通道部分突起),浇注液态的高分子材料,然后将固化后的高分子材料与阳模剥离,得到具有微通道芯片的这种制备微芯片的方法称为模塑法。模塑法的关键在于模具和高分子材料的选择,理想的材料应相互之间粘附力小,易于脱模。

微通道的阳膜可由硅材料、玻璃、环氧基SU-8负光胶和PDMS等制造。硅或玻璃阳膜可采用标准刻蚀技术。PDMS模具可通过直接浇注于由硅材料、玻璃等材料制的母模上制得。 

浇注用的高分子材料应具有低粘度,低固化温度。在重力作用下,可充满模子上的微通道和凹槽等处。可用的材料有两类:固化型聚合物和溶剂挥发型聚合物。 

虽然模塑法受限于高分子材料,但该法简便易行,芯片可大批量复制,且不需要昂贵的设备,是一个可以制作廉价分析芯片的方法。

(4)注塑法

注塑法的工艺是通过光刻和刻蚀技术在硅片上刻蚀出电泳芯片阴模,用此阴模进行24h左右的电铸,得到0.5 cm厚的镍合金模,再将镍合金模加厚,精心加工制成金属注塑模具,将此模具安装在注塑机上批量生产聚合物微流控芯片基片。

在注塑法制作过程中,模具制作复杂,技术要求高,周期长,是整个工艺过程中的关键步骤。一个好的模具可生产30 ~ 50万张聚合物芯片,重复性好,生产周期短,成本低廉,适宜于已成型的芯片生产。

(5)LIGA技术

LIGA是德文Lithographie,Galvanoformung,Abformung三个字的字头缩写。LIGA技术是由光刻、电铸和塑铸三个环节组成。

准LIGA技术是用紫外光光源来代替LIGA技术中的同步辐射X光深层光刻,然后进行后续的微电铸和微复制工艺。它不需要同步辐射X光光刻和特制的X光掩膜板,有利于实现微机械器件的大批量生产。根据紫外光深层光刻的工艺路线的不同,准LIGA技术又可分为多层光刻—LIGA、硅模深刻蚀—LIGA和SU-8深层光刻—LIGA三类。

(6)激光烧蚀法

激光烧蚀法是一种非接触式的微细加工技术。它可直接根据计算机CAD的数据在金属、塑料、陶瓷等材料上加工复杂的微结构,已应用于微模和微通道的加工。  这种方法对技术设备要求较高,步骤简便,而且不需超净环境,精度高。但由于紫外激光能量大,有一定的危险,需在标准激光实验室中进行操作,使用安全保护装备和防护眼镜。

(7)软光刻

软光刻(soft lithography)是相对于微制造领域中占据主导地位的光刻而言的微图形转移和微制造的新方法,以自组装单分子层、弹性印章和高聚物模塑技术为基础的微细加工新技术。它能制造复杂的三维结构及不规则曲面;能应用于生物高分子、胶体、玻璃、陶瓷等多种材料;没有相关散射带来的精度限制,可以达到30 nm ~ 1 μm级的微小尺寸; 因此软光刻是一种便宜、方便,适于实验室使用的技术。

软光刻技术的核心是弹性模印章,可通过光刻蚀和模塑的方法制得。PDMS是软光刻中最常用的弹性模印章。软光刻的关键技术主要包括微接触印刷、再铸模、微传递成模、毛细管成模、溶剂辅助成模等。

软光刻技术还存在着一些缺陷,如PDMS固化后有1%的收缩变形,而且在甲苯和乙烷的作用下,深宽比将出现一定的膨胀;PDMS的弹性和热膨胀性使其很难获得高的准确性,也使软光刻在多层面的微加工中受到限制;由于弹性模太软,无法获得大的深宽比,太大或太小的宽深比都将导致微结构的变形或扭曲。

如今微流控芯片已经成为涵盖了从分离分析、化学合成、医学诊断学、细胞生物学、神经生物学、系统生物学、结构生物学、微生物学等一系列应用研究领域的综合性交叉学科。

微流控技术的应用

基于微流控芯片的代表性关键技术

① 微流控分析芯片是新一代床旁诊断(Point of care testing, POCT)主流技术,可直接在被检对象身边提供快捷有效的生化指标,使现场检测、诊断、治疗成为一个连续的过程;

② 微流控反应芯片以液滴为代表,是迄今为止最重要的微反应器,在高通量药物筛选,单细胞测序等领域显示了巨大的威力;

③ 微流控细胞/器官操控芯片是哺乳动物细胞及其微环境操控最重要技术平台,渴望部分代替小白鼠等动物模型,用于验证候选药物,开展药物毒理和药理作用研究。

1、新一代床旁诊断(POCT)技术——Microfluidics-based POCT

POCT可直接在被检者身边提供快捷有效的生化指标,现场指导用药,使检测、诊断、治疗成为一个连续过程,对于疾病的早期发现和治疗具有突破性的意义。

POCT仪器发展趋势应是小型化、“傻瓜”式,操作简单,无需专业人员,直接输入体液样本,即可迅速得到诊断结果,并将信息上传至远程监控中心,由医生指导保健。目前,市场上有多种即时诊断方法,简单的流动测试工作没有流体管理技术,而当测试复杂性增加时,微流控技术是必要的。

微流控芯片所具有的多种单元技术在微小可控平台上灵活组合和规模集成的特点已使其成为现代POCT技术的首选,经过近年的发展,已涌现了一批微流控芯片POCT分子诊断和免疫诊断的成功案例。

芯片

芯片

POCT-用于免疫检测主动式微流控芯片

动式微流控技术与其他POCT技术的区别

芯片

2、PCR-微流控芯片CE

微型反应器是芯片实验室中常用的用于生物化学反应的结构,如毛细管电泳、聚合酶链反应、酶反应和DNA 杂交反应的微型反应器等 。其中电压驱动的毛细管电泳(Capillary Electrophoresis , CE) 比较容易在微流控芯片上实现,因而成为其中发展最快的技术。

它是在芯片上蚀刻毛细管通道,在电渗流的作用下样品液在通道中泳动,完成对样品的检测分析,如果在芯片上构建毛细管阵列,可在数分钟内完成对数百种样品的平行分析。

国际上公认的PCR 产物检测共有五种方法,按其灵敏度高低顺序排列为:毛细管电泳法、固相杂交法、液相杂交法、高压液相杂交法和凝胶电泳法(不推荐临床) 。

微流控芯片CE 以毛细管电泳为该芯片主体,无需进行探针杂交,受检样品的信号获得率接近百分之百。

微流控芯片CE 可检测15~7500bp范围的PCR 产物,分辨率可达20bp ,样品微量化使扩散进一步减少,分离效果极好,每孔可供多个不同的PCR 产物作同时分析。

目前其应用主要集中在核酸分离和定量、DNA 测序、基因突变和基因差异表达分析等。另外,蛋白质的筛分在微流控芯片中也已有报道针对病原微生物基因组的特征性片段、染色体DNA 的序列多态型基因变异的位点及特征等,设计和选择合适的核酸探针,经PCR 扩增后检测,就能获得病原微生物种属、亚型、毒力、抗药、致病、同源性、多态型、变异和表达等信息,为疾病的诊断和治疗提供一个很好的切入点。

自1992 年微流控芯片CE 首次报道以来,进展很快。首台商品仪器是微流控芯片CE ( 生化分析仪,Aglient) ,可提供用于核酸及蛋白质分析的微流控芯片产品。

3、哺乳动物细胞及其微环境操控平台——微流控芯片仿生实验室

由于微流控芯片的构件尺寸和细胞吻合,并可同时测定物理量、化学量和生物量,它已成为对哺乳动物细胞及其微环境进行操控的最具潜力的平台。

目前已可以构建微米量级且相对封闭的三维细胞培养、分选、裂解等操作单元,并把这些单元成功延伸到组织和器官。

器官芯片是一种更接近仿生体系的模式,可在一块几平方厘米的芯片中培养各种活体细胞,形成组织器官,乃至由不同器官芯片进一步组成活体芯片,从而模拟一个活体的行为并研究活体中整体和局部的种种关系。

在药学领域,器官芯片将被部分替代小白鼠等模型动物,用于验证候选药物,开展毒理和药理作用研究。

细胞培养微流控芯片

微流控芯片技术作为一种新兴的技术手段,已经从最初单纯的毛细管电泳的微型化技术,演变成为一种涵盖了从基础生物技术到生物医学诊断等各个领域的富有活力的工具性方法平台。

随着微流控芯片技术的不断发展,微流控芯片技术与其他的代表性技术会在更为广泛的研究领域中交叉渗透,快速发展,而且也会更加直接地深入到人们的日常生活甚至平常使用的器件当中。

阻碍微流控技术发展的瓶颈包括制造加工、集成度以及与宏观系统的接口等应用方面的问题。今后微流控芯片会朝着分析成分的多样化、制作基材的多样化、研究方法的多样化和系统的微型化与集成化的方向发展。

集中在大规模、高通量、低消耗的生命科学和分析化学实验中,包括单细胞培养与分析、干细胞操控与培养、单分子生物物理学、高通量的细胞与分子生物学筛选实验、药物发现、高通量合成生物学、高通量测序技术、单细胞基因组学等。

基于微流控人体体液的生化分析也特别适合目前大火的互联网医疗。  智能检测或诊断的医疗器械终端(家用)与互联网的大数据结合,这一块也将大大的推进了人类医疗健康系统的发展。 

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