低成本荧光和明场显微镜设计

荧光显微镜是一种用于可视化

在这个指导中，我将回顾荧光显微镜的基本原理以及如何构建三个不同的低成本荧光显微镜。这些系统通常花费数千美元，但最近有一些努力使它们更容易获得。我在这里介绍的设计采用智能手机，dSLR和USB显微镜。所有这些设计也可用作明场显微镜。让我们开始吧！

第1步：荧光显微镜概述

要了解荧光显微镜的基本概念，想象一下夜晚的茂密森林，树木，动物，灌木丛以及其他生活在森林中的森林。如果您将手电筒照射到森林中，您会看到所有这些结构，并且很难想象出特定的动物或植物。假设您只对在森林中看到蓝莓灌木感兴趣。要做到这一点，你要训练萤火虫只被蓝莓灌木丛所吸引，这样当你看着森林时，只有蓝莓灌木丛才会亮起来。你可以说你用萤火虫标记蓝莓灌木丛，这样你就可以看到森林里的蓝莓结构。

在这个类比中，森林代表了整个样本，蓝莓灌木代表您想要可视化的结构（例如特定细胞或亚细胞器），萤火虫是荧光化合物。在没有萤火虫的情况下单独照射手电筒的情况类似于明视场显微镜。

下一步是了解荧光化合物（也称为荧光团）的基本功能。荧光团实际上是小型物体（纳米尺度），设计用于连接样品中的特定结构。它们吸收窄范围波长的光并重新发射另一波长的光。例如，一个荧光团可以吸收蓝光（即荧光团被蓝光激发），然后重新发射绿光。通常这通过激发和发射光谱来概括（上图）。这些图表显示了荧光团吸收的光的波长和荧光团发射的光的波长。

显微镜设计与普通明场显微镜非常相似，有两个主要差异。首先，照射样品的光必须是激发荧光团的波长（对于上面的例子，光是蓝色的）。其次，显微镜只需要收集发射光（绿光），同时阻挡蓝光。这是因为蓝光到处都是，但绿光只来自样品中的特定结构。为了阻挡蓝光，显微镜通常会有一种称为长通滤光片的东西，让绿光在没有蓝光的情况下通过。每个长通滤波器都具有截止波长。如果光的波长比截止波长，则它可以通过滤波器。因此，名称，“长途通行证”。更短的波长被阻挡。

第2步：用光学光学建模显微镜

这是一个额外的步骤设计显微镜的基本原则。没有必要构建荧光显微镜，因此如果您不想深入研究光学，可以跳过它。

明场和荧光显微镜都可以使用射线光学器件建模。射线光学的基本前提是光的行为类似于远离光源传播的光线。当你环顾房间时，你会看到窗外的阳光或者灯泡所带来的光线。然后光被房间中的物体吸收或反射。一些反射光会使它朝向你的眼睛。如果物体被照亮，您可以想象物体上的每个点在所有方向上发射光线（上图）。镜头，就像我们眼中的镜头一样，将光线聚焦到一点，这样我们就能看到物体。没有镜头，光线继续向外传播，不会形成图像。

那么我们如何制作放大小物体的光学系统呢？为了理解设计，你真的只需要知道两个方程：薄透镜成像和放大方程：

1/f = 1/si + 1/so

M = -si/so

f是镜头的焦距。较短的焦距意味着镜头具有更多的聚焦能力。

对象距离也是如此;镜头和物体之间的距离（例如树）。

si是图像距离;镜头与图像形成位置之间的距离

M是放大率;图像相对于对象有多大。对于显微镜，我们想要增加放大倍数。

有关薄透镜方程的完整教程，请查看此Khan Academia视频。在上面的gif中，您可以看到物体移近镜头的距离会增加图像距离，从而增加放大倍率。带有两个箭头的垂直线表示镜头。

宏观摄影 - dSLR设计1

从这些方程式中，我们可以看到，如果我们使用单镜头，然后放大图像的方式是增加图像距离。这是通过将镜头远离传感器移动相机来实现的。许多DIY微距摄影都是通过使用扩管器简单地移出镜头来完成的。这是一个很好的技巧，为昂贵的宏观透镜提供了便宜的替代品。要增加放大倍率，您还可以减小镜头的焦距。翻转镜头的原因稍微复杂一些，需要了解光学系统的主平面。如果您正在寻找解释，请告诉我们！

USB显微镜

USB显微镜以相同的方式工作。它们经过专门设计，可以非常靠近镜头拍摄物体。物体越接近镜头，放大倍数越大。它们还有几个可以移动的镜头元件，让您可以在不同的距离聚焦，类似于变焦镜头。除了使用的镜头系统，它们与网络摄像头非常相似。

智能手机设计

对于智能手机，图像距离是固定的（即您无法移动镜头）。那么我们怎么把它转换成显微镜呢？如果重新排列上面的等式，您会发现通过缩短镜头的焦距可以增加放大倍率：M = si/f -1。打开手机更换相机镜头并不是最好的选择，因此您可以在手机外面添加双凸透镜。通过添加另一个镜头，可以减少镜头系统的有效焦距。我见过人们使用一次性相机镜头和激光指示镜头。

无限远校正显微镜 - dSLR设计2

我走的最终设计在这个教学中，与实验室中的显微镜设计最为相似。设计中有两种镜头系统：物镜和镜筒。物镜是最接近样品的组分。将样品放置在焦平面处，使得物镜外的光实际上不形成图像（即，si =无穷大）。图像由管透镜形成在传感器上。该系统的放大倍数由物镜和镜筒焦距的比值给出。以下是有关具有此设计的明场显微镜的更多信息的视频。

步骤3：供应清单

所有设计

耗材

激发LED：WS2801/WS2811或高功率蓝光LED

长通滤波器：Thorlabs，Edmund光学器件，Ealing，昂贵选项：Semrock

帮助保持滤波器

准备好的显微镜载玻片

Arduino Nano

按钮

1kOhm电阻器

4X M3x12螺栓

4X M3螺母

坚固的塑料或盖玻片

荧光染料（例如荧光笔墨水） ，荧光素，还是这个？）

工具：

适配器的3D打印机

电钻

热胶枪

塑料移液器

剪刀

艾伦扳手

LED灯条的烙铁

1。智能手机设计

智能手机;我使用了我的iPhone 5s

一次性相机镜头，激光指示镜头或光点镜头

智能手机座

2。 USB摄像头设计

USB显微镜

6mm直径磁铁

3。 dSLR设计

dSLR;我使用了我的尼康D5000

管镜头; 180毫米消色差双合透镜

无限校正物镜

2英寸直径镜头管

安装到SM2适配器

挡圈

步骤4：构建灯具

荧光显微镜的一个关键区别是光源。荧光显微镜代替在明视场显微镜中使用的白光（即许多波长），需要特定颜色的光（即窄波长范围）。例如，蓝光的波长约为488nm。

我决定用可寻址的LED条构建荧光显微镜，以便在荧光和明场成像之间切换。该支架设计用于我在这个教学中展示的所有三种显微镜设计。我在Fusion360中设计了它，然后3D打印了三个部分。安装座向内倾斜LED，以最大化入射到样品上的光。在gif中，您可以看到它如何与USB显微镜集成。对于其他显微镜，它只是固定LED。

首先将一个M3螺母添加到黑色LED支架的插槽中，然后滑入M3x12螺栓。螺栓和螺母用作固定螺丝，将USB显微镜固定到位。接下来，从W2801或WS2811 LED灯条上切下8个LED，然后将LED推入孔中。将红色电缆连接到5V，蓝色电缆连接到Gnd，白色电缆（数据）连接到D2。对于显微镜我想循环几种颜色，所以我添加了一个连接到D3针的按钮。附件是运行光源的代码。

接下来，在灰色LED底座的狭缝中添加四个M3螺母，并将LED组件放在顶部。添加盖板，滑入M3螺栓，然后用通用扳手拧紧。然后可以将整个组件安装到具有圆形底部的黑色底座上。

步骤5：准备荧光样本

也许荧光显微镜中最棘手的部分是制作标记样品。挑战在于将荧光团仅用于特定结构，这是一个复杂的化学过程。您可以订购荧光载玻片，就像这些小鼠肾脏载玻片一样，但它们很贵。校准载玻片也可用，可用于验证荧光显微镜。

要自行制作低成本荧光灯，您需要荧光灯（例如荧光笔液，荧光素等），硬塑料（或盖玻片），透明胶带，塑料移液器和吸收溶液的材料。将几滴荧光溶液添加到想要在图像中发光的结构中。在我的例子中，我正在标记一些纱线。将物体放在纸巾上以吸收excel液体。请记住，您不希望荧光液进入样品中的任何其他物质！

一旦确定标签物是干燥的，将其添加到盖玻片上的其余样品中。我加了一张没有荧光液的薄纸。您可以使用一块硬塑料切割成盖玻片，而不是盖玻片。用胶带将样品贴在盖玻片上。您现在已准备好对荧光样品进行成像！请注意，荧光溶液可能会变干并且随着时间的推移也不会起作用。

我必须制作荧光样品的另一个想法是将花放入荧光溶液中。荧光溶液将穿过植物的静脉并标记它们。以下是有关荧光花的更多信息。

步骤6：智能手机荧光显微镜

从一次性相机中取出镜头，然后使用3D打印机支架将镜头滑过智能手机。如果您没有3D打印机，只需将镜头边缘粘贴到手机上即可。甚至还有专为智能手机显微镜设计的更好的镜头，您也可以从Smart Micro Optics购买。

通过这种简单的设置，您手中已经拥有了一台超棒的数字明场显微镜。以下是构建这些类型显微镜的更多资源。上面你可以看到我使用一次性相机镜头和iPhone5s拍摄的一些照片。如果您想了解其工作原理，请查看步骤3.

现在进入荧光显微镜。将智能手机安装在三脚架上，然后将光源放在智能手机后面。将荧光样品放在智能手机和光源之间。最后，使用帮助手在样品和智能手机之间移动过滤器。滤光片将阻挡蓝色激发光。

用这台显微镜拍摄的明场结果确实令人印象深刻，但我对荧光成像感到失望。主要问题是iPhone的自动色彩和曝光校正。如果不控制这些功能，整个框架将变为蓝绿色，荧光标记的字符串不会弹出。可能有一个解决办法，因为我发现了青山卫和Aydogan Ozcan的这款智能手机荧光显微镜。

步骤7：USB荧光显微镜

首先，您需要3D打印过滤器支架。 STL文件如下。所有胶水磁铁都朝向与过滤器支架相同的方向。然后在与固定LED的安装座相反的方向上粘贴磁铁。当这两个组件都放在LED底座中时，它们将过滤器锁定到位。将USB显微镜滑入LED安装座并拧紧固定螺钉。您还可以在USB显微镜周围添加画家的胶带，以确保紧密贴合。

要在明场和荧光显微镜之间切换，请滑动过滤器支架。长通滤波器将位于USB显微镜前面，用于荧光成像。然后打开LED灯条，使右侧激发灯亮（可能是蓝光）。现在滑入荧光样品并保存一些图像。我使用Mac上的Digital Viewer程序来使用USB显微镜。以上是一些例子。我对结果印象非常深刻！

步骤8：DSLR显微镜

最终设计提供最高放大倍率和最佳质量，但它是最昂贵。将Fmount-to-SM2适配器添加到dSLR，然后拧入2“和3”管扩展器。然后安装180毫米消色差双合透镜。在物镜盖上钻一个孔，使光可以通过，然后将其推入自定义物镜到SM2适配器（STL文件在上面）。在镜筒后添加一个3英寸，2英寸和1.5英寸的扩管器，然后是物镜。

接下来，您需要将相机牢固地放在桌子上，然后是长通滤镜，样品和光源。我在我的CT扫描仪项目中使用了我的dSLR安装（参见那个instructable的第5步），但你也可以使用三脚架。可以使用助手将过滤器固定到位。将滤光片移开以进行明场成像。上面的前两个示例图像是相同的样本，一个在明场模式，另一个在荧光模式。注意结构的主要区别！我认为这是荧光显微镜有用的最好例子。如果样本标记良好，您可以将特定结构可视化并将其他所有内容清除。

处理图像的另一个技巧是简单地调高对比度。您可以在上面包含明场和荧光图像的两幅图像中看到。

步骤9：显微镜比较

以上是荧光和明场成像结果的几个并列比较。 dSLR设计具有最佳的分辨率，对比度和整体图像质量，但是最昂贵。我认为USB显微镜是使荧光显微镜启动和运行的最佳整体方案。唯一的主要成本是长通滤波器，大约60美元。我仍在寻找更便宜的替代品来降低显微镜的总体成本。我对iPhone的结果感到有些失望，但如果我可以手动调整曝光和色彩校正（任何想法？），这个设计可能会有所改进。

USB显微镜上的焦点旋钮也可以使成像成像与dSLR相比，它更容易，这需要精细移动样品。有高精度线性平台可用，但我能找到的至少是100美元。我使用卡尺制作了一个廉价线性舞台的原型，但没有在这个教学中显示出来。 MyPhotonics提出了一些由乐高制作的精彩翻译舞台设计。我没有试过它们，但它们看起来像是另一个很好的低成本解决方案。

审核编辑 黄昊宇