纤维化和再生分子轨迹的基本机制研究

再生是组织修复的“必杀技”，但皮肤损伤通常会产生纤维化的、无功能的疤痕。疤痕是指皮肤损伤后的纤维化，通过用非功能性结缔组织替代功能性组织来确保伤口能够尽快愈合。由于疤痕没有皮肤的毛发或腺体，因此也不具有正常的体温调节或屏障功能。尽管纤维化带来的医疗负担巨大，但目前尚无有效的治疗方法，部分原因是缺乏对再生和纤维化愈合的基本机制的了解。所以想要发展促再生疗法，需要深刻理解从损伤到纤维化或再生的分子轨迹。

近日，美国斯坦福大学医学院研究组在Cell Stem Cell（IF：24.633）上发表了一篇题为Multi-omic analysis reveals divergent molecular events in scarring and regenerative wound healing的文章，该研究以单细胞多组学方式（单细胞转录组+蛋白质组）描绘了YAP抑制背景下瘢痕与伤口再生的分子轨迹。   研究发现，使用YAP (Yes-associated protein) 抑制剂可以防止成纤维细胞纤维化，并产生ENF (En-1-negative fibroblasts) 介导的再生，这一过程包括真皮附件如毛囊 (HF) 和腺体的恢复、细胞外基质 (ECM) 的结构与未发生损伤皮肤 (UW) 的结构相同以及具有相似的弹性。

纤维化和再生创伤的多模态分析

研究分析了7个时间点的小鼠创面和皮肤：UW皮肤、术后第2天（炎症期）、术后第7天（成纤维细胞增殖期）、术后第10天、术后第14天（伤口重新上皮化、成纤维细胞产生细胞外基质）、术后第21天和术后第30天（成纤维细胞重塑ECM）。采用夹板切除伤口模型，该模型能够防止皮肤松弛小鼠典型的伤口快速收缩，从而可以对伤口恢复过程进行监控。伤后立即在创面注射YAP抑制剂或对照缓冲液，对伤口进行长时程多模分析。   对照组创面形成明显的纤维瘢痕，有密集、线性排列的ECM纤维，无毛囊和腺体；而YAP抑制剂处理后的创面，有毛囊和腺体再生，ECM纤维密度较低，且生长方向更随机。通过YAP敲除对该结果进行再次确认，抑制剂与对照组之间处理的差异并非由于抑制剂的脱靶效应引起。   根据FACS策略进行细胞分类，分离成纤维细胞(Lin-) 和其他细胞 (主要是免疫细胞；Lin+)。对一半的细胞进行scRNA-seq分析，总计2986个细胞。发现成纤维细胞在YAP抑制剂处理的创面中轻微增加；然而，对照组和YAP抑制剂创面的细胞比例大体相似，这表明YAP、抑制剂可能通过改变细胞表型而不是相对表征（或通过改变细胞类型中的亚群表征）来诱导再生。剩余的细胞进行蛋白质组学分析（timsTOF质谱分析）。主成分分析发现Lin-和Lin+蛋白组学标本在不同时间点上差异很大，而PBS样本和YAP抑制剂样本的差异则比较狭窄，这表明蛋白质组学分析可以在更广泛的修复动力学中捕获连贯的纤维化变化。

疤痕形成与再生创面修复的多模态分析

(B) 创伤愈合随时间变化的小鼠配对多模态分析实验策略。

(C) 按细胞类型（左上）、处理组（右上）、小鼠个体（左下）和POD（右下）着色的scRNA-seq细胞的多重投影。

(D) PBS和维替泊芬（YAP抑制剂）处理的伤口按时间点的细胞类型比例。

(E) Lin-（成纤维细胞，上）和Lin+（非成纤维细胞，下）细胞。

(F) 顶部，量化294个ECM参数的图像处理和分析管道示意图轮廓。底部为对照（左）和椎体芬（右）伤口随时间的t-SNE图。绿色阴影区域，UW皮肤簇；叠加箭头，ECM随时间演化。

识别修复的分子轨迹

因为成纤维细胞是瘢痕形成的主要驱动因素，研究假设YAP抑制剂通过改变成纤维细胞表型促进再生，并将scRNA-seq分析集中在成纤维细胞上。单细胞分析发现再生过程和纤维化过程并不是相互排斥的，具有促再生活性的细胞可能存在于瘢痕创面之中，但是在没有干预的情况下（例如YAP抑制剂处理），促纤维化分子的反应会覆盖再生的活性，并导致纤维化瘢痕表型。   此外，还分析了另外两种与伤口相关的细胞亚群：骨髓细胞和淋巴细胞。髓系细胞假时间分析显示，炎症基因（如Ccl6、Ccl9和Cxcl2）在早期富集，抗原呈递基因（如H2复合物）在后期富集。然而，这些基因在PBS和YAP抑制剂细胞中表达相似，表明该分析没有区分纤维化和再生愈合。淋巴样细胞假时间分析也没有区分纤维化和再生的伤口，而是分别反映了早期和晚期的NK和B/T细胞浸润。发现抑制剂处理与对照组相比，免疫细胞的组成并没有出现太大的差异。因此，疤痕表型是否产生并非是由于免疫细胞的差异，其原因可能还是主要集中在成纤维细胞之中。   使用CellChat分析scRNA-seq数据。CellChat强调了再生臂中涉及疤痕 (PBS) 成纤维细胞和非典型Wnt信号的促炎信号（如CXCL和IL6）的增加。这些独特的功能富集项，以及该组中较低的Dpp4表达，暗示了由非瘢痕性ENF设计的独特的分子愈合轨迹。  

成纤维细胞相互作用的CellChat分析

(A)  细胞群对间配体-受体相互作用的强度。边缘宽度与配体-受体对的数量成正比。

(B)  如(A)中，按细胞种群划分的子集。

(C)  热图显示了基于指定信号网络(ncWNT, noncanonical Wnt)的计算网络中心性度量的每个细胞群的相对重要性。

(D和E)推断出的分泌细胞输出(D)和输入(E)通信模式，显示出推断出的潜伏模式和细胞群之间的对应关系(左)和信号通路(右)。

伤口纤维化和再生轨迹标记物的研究

基于综合多模态分析，试图验证不同创伤表型中关键基因的相关性。图谱中差异表达的基因指向了Wnt信号通路，包括Wnt的靶标基因、拮抗基因以及一个重要的调节因子Trps1。先前的研究表明Trps1是Wnt信号通路的主要调节因子，且与皮肤腺体的发育、生长和增殖相关。通过Trps1基因敲除以及过表达实验，研究确认该基因对于伤口再生是必要且充分的。支持了ENF介导的愈合（低Dpp4）在YAP抑制（低Ankrd1）的伤口中通过Wnt激活（高Trps1和Rspo1）实现HF再生这一发现。

确定Trps1在再生中的功能意义

鉴于Trps1在Wnt信号转导、HF形态发生和YAP调控中的重要性，以及Trps1+成纤维细胞和HF再生的空间关系，研究试图确定Trps1在创面再生中的作用。综合多模态分析区分了两种修复轨迹。第一种是EPF介导的 (Dpp4+)，以机械激活（高核YAP，Ankrd1+，Trps1-）为特征，导致疤痕ECM。二是ENF介导 (Dpp4-)，缺乏机械活化（低核YAP，Ankrd1-，Trps1+），并通过Wnt激活导致正常ECM和HF的再生。   总结一下，该研究通过对伤口再生进行YAP抑制剂处理后的长时程多模分析，建立了伤口再生的分子生物学、细胞生物学以及蛋白质图谱，对研究皮肤伤口再生与纤维化瘢痕形成的阻断具有重要价值。 审核编辑：郭婷