一种稳健且高灵敏度的电化学发光生物传感器平台

新冠病毒（SARS-CoV-2）具有高度传染性，目前的检测均基于实时逆转录PCR检测技术，虽然效率高，但其技术要求高且价格昂贵，不适合资源相对稀缺的地区大规模使用。

据麦姆斯咨询报道，江苏省原子医学研究所谢敏浩教授课题组基于CRISPR/Cas12a，开发了一种稳健且高灵敏度的电化学发光（ECL）生物传感器平台，用于检测SARS-CoV-2 RdRp（RNA依赖性RNA聚合酶，简称RdRP）基因。相关研究内容发表在Chemical Engineering Journal上。

为了构建该生物传感器平台，研究人员在ECL生物传感器电极表面修饰DNA四面体结构，DNA四面体可以与DNA1形成DNA三链复合物，在核酸扩增反应的初始状态下，引入两个发夹DNA（H1和H2），在存在核酸外切酶III（Exo III）的情况下，可以同步切割、释放H1a和H2a。只有当H1a和H2a同时存在时，才能形成H1a/H2a双链，从而激活CRISPR/Cas12a的活性，并允许CRISPR/Cas12a切割DNA1（图1B）。如果反应体系中不存在目标物质，则无法形成H1a/H2a双链，也无法激活CRISPR/Cas12a的活性并切割DNA1。其中体系中的DNA1与电极表面的DNA四面体结合将引起ECL信号的变化，特别的是，该生物传感器平台可以在pH=10时“再生”（图1A），使其能够持续长期使用，从而准确监测待测核酸浓度。

图1 基于CRISPR/Cas12a反式活性测定SARS-CoV-2 RdRp基因的pH诱导再生生物传感器示意图

为了进一步研究该传感器平台的特征，研究人员首先通过透射电子显微镜（TEM）对合成的Au-g-C₃N₄进行表征，观察到金纳米粒子的直径约为17nm，且均匀分散在C₃N₄纳米片的表面（图2A），此外还通过紫外表征发现合成的Au-g-C₃N₄将会在360nm和520nm之间有特征峰（图2B），介于AuNPs（520nm）和g-C₃N₄（360nm）特征峰之间，并通过能量色散X射线光谱仪（EDX）进行元素分析（图2C、D），均表明Au-g-C₃N₄成功合成；通过聚丙烯酰胺凝胶电泳（PAGE）表征DNA四面体的成功合成（图2E）。

图2 Au-g-C₃N₄和DNA四面体的表征

在本研究中，发光信号最初来源于g-C₃N₄，其可能的发光机理如下：g-C₃N₄在外加电压下获得一个电子，并转化为g-C₃N₄（1）；S₂O₈²⁻在外加电压下获得一个电子，并降低为SO₄²⁻和SO₄⁻（2）；SO₄⁻和g-C₃N₄⁻之间发生电子转移，并且g-C₃N₄⁻在激发态下变成g-C₃N₄*（3）；g-C₃N₄*的激发态完成了电子跃迁，并转变为基态g-C₃N₄，同时在460nm处产生光（4）。

为进一步表征pH介导再生生物传感器逐步修饰过程的电化学响应，研究人员采用了循环伏安法（CV）。裸玻碳（GCE）电极的CV曲线（曲线a）显示了最大电流峰值。当Au-g-C₃N₄（曲线b）沉积在电极表面时，电流峰值显著降低。当DNA四面体和6-巯基己醇（MCH）（曲线c）继续在电极表面进行进一步修饰时，电流峰值继续降低，表明不良导电物质吸附在电极表面，这与DNA四面体和MCH的绝缘性能一致。DNA1继续通过四面体吸附在电极表面后，电流继续减少（曲线d），导致电流峰值出现类似的减少。同时，通过图3B所示的电化学阻抗谱（EIS）对pH介导再生生物传感器的逐步构建过程进行了表征。电化学CV和EIS表征均证明成功合成了pH介导再生生物传感器。研究人员发现60min为Exo III辅助扩增反应时间的最佳条件（图3C），90min后三链核酸形成达到稳定(图3D)。

图3 使用循环伏安法和电化学阻抗谱法表征生物传感器的构造

最终将构建的比率ECL生物传感器在优化条件下用于检测SARS-CoV-2 RdRp基因。图4A描绘了ECL信号随SARS-CoV-2 RdRp基因浓度增加的变化。发现ECL（620nm）/ECL（420nm）的变化值也与ECL（620nm）/ECL（420nm）呈线性关系（图4B）：Y=6.466 × 10⁻⁴X-0.034，R²=0.9950，其中Y是ECL（620nm）/ECL（420nm）的比值，X是RdRp基因的浓度，根据检测极限（LOD）的计算公式：LOD=3σ/k，该生物传感器的LOD为43.70aM。

图4 不同靶标DNA浓度下ECL及ECL（620nm）/ECL（420nm）信号的变化

将修饰后的电极浸入含有1pM SARS-CoV-2 RdRp基因的PBS中，连续扫描10个循环。ECL信号在460nm（图5A）的相对标准偏差（RSD）为1.7%，ECL信号稳定在620nm（图5B）时RSD为2.5%，这些实验结果均表明该生物传感器具备优异的稳定性。最后，研究人员研究了构建的生物传感平台在不同pH值下的pH介导再生。研究发现，当生物传感器在TAE缓冲液（pH=10.0）中培养时，形成三链DNA的生物传感器可以在该pH值下使得DNA从电极表面解离而再生（图5D）。

图5 pH诱导的再生生物传感器的稳定性和选择性

总体来说，谢敏浩教授课题组提出的基于CRISPR/Cas12a的pH介导再生生物传感器，其用于诊断SARS-CoV-2 RdRp基因的检测灵敏度可达到43.70aM，具有临床应用的潜力。

论文链接：

https://doi.org/10.1016/j.cej.2021.132472

审核编辑 ：李倩