一种响应多种芳香族和吲哚类诱导剂的转录因子生物传感器系统

变构转录因子（Allosteric transcription factor，aTF）包含几个大的蛋白质家族，能够通过结合效应物引发别构效应进而准确地调控靶基因的转录。其分子机制主要是通过小分子的结合，能够使得DNA结合结构域的构象发生变化，使在特定的DNA结合序列上发生结合或解离。aTF是微生物工程中的重要工具，在代谢工程、生物技术和合成生物学中都有着广泛的应用。   最近，加拿大康科迪亚大学（Concordia University）的研究人员在《ACS Synthetic Biology》（IF=5.11）期刊上发表了一项重要研究成果，该团队开发了一种响应多种芳香族和吲哚类诱导剂的转录因子生物传感器系统，该方法利用空肠弯曲菌（Campylobacter jejuni）的TetR家族阻遏物CmeR，构建了aTF基因线路，该线路可在大肠杆菌和酿酒酵母中作为水杨酸生物传感器，同时也证明了调节CmeR的启动子对多种芳香和吲哚诱导剂也可起响应。  

研究人员一开始发现来自空肠弯曲杆菌的TetR家族抑制因子——CmeR，它能够调节外排泵来响应肠道胆汁盐的变化，并且CmeR还被证明可以结合水杨酸和甘油，包括脂肪族、胆汁盐和芳香族分子，具有多配体特异性。其多配体特异性引发了研究人员的兴趣，他们想利用CmeR的这一特性，设计新的基因线路。   ►首先，研究人员构建了一个基因线路，来研究大肠杆菌中能调控CmeR的诱导物，其中CmeR用IPTG诱导的Ptac启动子表达，第二个启动子P2表达绿色荧光蛋白（eGFP），该启动子能响应水杨酸。  

大肠杆菌中的基因线路   由于eGFP的启动子响应水杨酸，如果CmeR的表达量变大，会与P2启动子竞争水杨酸，导致GFP表达降低，因此通过诱导CmeR的表达可以抑制荧光（即抑制eGFP的表达），而加入越来越多的诱导剂水杨酸，会导致CmeR与水杨酸结合饱和，同时激活P2启动子，表达更多的eGFP。当水杨酸添加到1mM时候，eGFP的表达量是添加1mM IPTG 的情况下的5倍。通过调节IPTG和水杨酸浓度，我们可以进一步调控eGFP的表达水平。   ►接着，研究人员探索了CmeR的配体特异性。首先将携带该基因线路菌株去“感受”各种芳香族、吲哚和脂肪族分子。通过观察报告基因eGFP的荧光强度，来表征CmeR的响应程度。荧光强度的增加范围从1.1倍（儿茶酚）到3.8倍（植物生长素吲哚-3-乙酸或IAA），同时也利用流式细胞仪表征了这些分子的剂量-响应，实验表明除了鉴定的同源诱导剂外，受CmeR调节启动子似乎也受色胺（色氨酸的胺衍生物）的最低程度诱导，而酪胺（酪醇的胺衍生物）不诱导表达。  

大肠杆菌表达情况   ►之后研究人员在真核生物酿酒酵母中也实现了该基因线路的功能。在这个线路中，CmeR由强启动子PTDH3启动表达。绿色荧光蛋白（EnvyGFP）由强启动子PCCW12表达，通过修饰，使PCCW12具有水杨酸响应性。  

酿酒酵母中的基因线路   研究人员用类似于在大肠杆菌的实验，得到的数据也证明CmeR在酿酒酵母中充当转录抑制因子，并且可被水杨酸诱导。并且也用相同的分子对基因线路剂量-响应的进一步表征，发现大肠杆菌和酿酒酵母中CmeR诱导曲线之间存在差异，后者表现出最大的荧光诱导，范围从1.8倍（乙酰水杨酸酯）到5倍（对香豆酸酯）。  

酿酒酵母表达情况   酿酒酵母回路与大肠杆菌回路相比，酿酒酵母CmeR回路中对其中许多分子都起反应，包括对同源诱导物水杨酸的反应，但总体上有所减弱，这可能是由于两种基因线路设计上差异，例如大肠杆菌是从多拷贝载体表达的，而在酿酒酵母中是单拷贝基因组整合。   ►总的来说，研究人员分别在原核生物大肠杆菌和真核生物酿酒酵母中对基于CmeR的水杨酸细胞生物传感器进行了构建和表征。除了水杨酸、胆汁盐、胆酸盐和牛磺胆酸盐外，还鉴定了多种芳香族和吲哚类诱导剂可作为大肠杆菌中CmeR的新配体。此前酪醇、色氨酸和酪胺都没有作为aTF调节的诱导剂。   值得一提的是，这种多配体特异性在同一途径中会导致不同分子可能存在显著的串联干扰，在代谢工程应用中直接利用CmeR会受到特异性的限制。但是利用这一特性，可以将CmeR这种多配体特异性使其成为检测分子的工具，以及定向进化的良好靶点。同时，鉴于CmeR配体的杂乱性，也可以研究其他芳香族和吲哚类分子在诱导空肠弯曲菌抗生素抗性中是否起作用。  

     论文链接： https://doi.org/10.1021/acssynbio.2c00063  

    审核编辑 ：李倩