一种集成式微流控液滴数字化等温扩增（LAMP）方法

尿路感染（Urinary tract infections，UTIs）是一种发病率和死亡率较高的感染性疾病，严重威胁人体健康和生命安全。尿路感染主要由大肠埃希菌（E.coli）引起，因而快速的病原学诊断对于合理使用抗生素和抑制细菌耐药性的产生具有重要作用。

数字化核酸分析，如数字PCR技术，是一种基于大规模分散体系的绝对定量分析方法，具有不依赖标准品的绝对定量分析能力，然而，现有数字化核酸分析产品，通常采用离线式模式，这些设备普遍体积庞大，同时多步离线操作耗时较长，并且容易操作失误和交叉污染，因而不适用于病原的现场快速检测。

据麦姆斯咨询报道，为了解决上述问题，来自华南理工大学及桂林电子科技大学的联合研究团队建立了一种集成式微流控液滴数字化等温扩增（LAMP）方法，用于尿路感染细菌的快速检测。相关研究成果以“集成式微流控液滴数字化等温扩增用于尿路感染细菌快速检测”为题，发表在《分析化学》期刊。

芯片设计与制作

研究人员设计并制备了一种集成了核酸提取、液滴发生和数字化核酸分析的微流控芯片。芯片包含三层结构（图1A），共有4个核酸提取单元的微池，液滴发生单元的水相通道入口与核酸提取单元的LAMP预混液池底部对接，油相通道入口与储油池底部对接。液滴收集池底部设置微柱阵列（直径100μm，间距80μm），用于支撑芯片顶层。

图1 芯片结构及操作流程图

（A）芯片由顶层、中间层和底层组成：顶层包含核酸提取单元的样品池、洗涤液池、洗脱液池、预混液池以及滴液发生单元的储油池，中间层包含液滴发生单元的液滴发生器和液滴收集池，底层为无结构平板玻璃；（B）微流控芯片上的核酸提取与液滴发生：（a）将样品混合液、洗涤液、洗脱液和LAMP混合液分别加载到指定的微池，（b）用磁力驱动磁珠分别进入含有洗涤液和洗脱液的液滴，（c）通过往复转移磁珠引发洗脱液液滴与LAMP混合液液滴融合，（d）注射器真空驱动液滴发生。

集成式微流控数字化核酸分析

核酸提取单元采用微流控序列液滴设计。程序化操控磁珠顺序通过含有样本/结合缓冲液、洗涤液和洗脱液的液滴，即可自动完成核酸-磁珠结合、核酸洗涤和洗脱。其后，拖动磁珠往返运动，引发洗脱液液滴与反应预混液液滴融合，即可构成完整的等温扩增反应体系。液滴发生单元使用注射器负压驱动油相和水相进入液滴发生器。十字型液滴发生器处，在油相剪切力作用下，水相被切割形成单分散液滴。为了调节水相流速，水相引入通道还设置了蜿蜒形的阻力调节器。

图2 芯片核酸提取方法的优化

（A）使用试剂盒提供的洗涤液提取核酸后的液滴LAMP；（B）使用酸化的1 × LAMP缓冲液作为洗涤液提取核酸后的液滴LAMP；（C）细菌裂解效率；（D）核酸回收效率。

液滴数字化LAMP

本研究采用浓度为8.835 × 10⁶CFU/mL的E.coli gDNA样品进行液滴LAMP，通过荧光成像分析确定阴性和阳性液滴的判定方法。如图3B所示，当以阴性液滴的平均荧光强度加3倍方差作为阈值时，获得的阳性率（29.46%）最接近理论值（30.15%），因此确定其为阳性判定阈值。

图3 液滴数字化LAMP反应条件的优化

（A）加热前后液滴体积变化情况；（B）阴阳性液滴区分阈值的判定，P代表阳性液滴，N代表阴性液滴；（C）EvaGreen核酸染料浓度的优化；（D）BST聚合酶浓度和反应时间的优化。

集成式数字化LAMP用于细菌定量分析

集成式数字化LAMP的整个分析过程可在1.5h内完成。采用集成式微流控芯片液滴数字化LAMP方法 E.coli ATCC25922菌悬液进行了分析。由于液滴数字化LAMP的检测靶标为细菌gDNA，因而测得的核酸浓度等于细菌浓度（图4）。由于数字化核酸分析技术对于病原菌的定量分析的精度高于定量培养法，并且引发尿路感染的细菌浓度范围较宽，因而集成式数字化LAMP可满足病原细菌定量检测的要求。

图4 集成式微流控液滴数字化LAMP用于E.coli定量分析

（A）梯度浓度稀释细菌样本的液滴数字化LAMP结果；（B）液滴数字化LAMP测得的核酸浓度与平板计数测定的细菌浓度的线性相关性。

集成式微流控数字化LAMP用于尿路感染细菌检测

利用建立的集成式微流控液滴数字化LAMP方法对13例E.coli尿路感染临床样本进行了分析。本方法与传统细菌平板计数法对于E.coli尿路感染的判定具有高度一致性。

综上所述，研究人员建立了一种集成式微流控芯片液滴数字化等温扩增方法，可在同一芯片上完成基于液滴的核酸提取、样本分散以及核酸等温扩增等过程，实现从样品输入到结果输出的全流程检测。采用模式样本和实际临床样本的测试结果确认了本方法的可靠性。本方法自动化程度高、操作简便、定量分析精度高、分析速度快，适用于医疗资源有限条件下的感染性病原现场快速检测。

论文链接：

https://doi.org/10.19756/j.issn.0253-3820.221085

审核编辑 ：李倩