无需扫描! SPINDLE可实现3D高精度单分子定位成像！

介绍

超分辨率显微成像是一系列能够使研究人员能够“打破”光学显微镜衍射障碍的方法，在该系列方法中分辨率最高的技术为光激活定位显微技术（PALM）。这些方法依赖于在数千帧中对单个分子的随机子集进行定位（SMLM），并将这些个体的定位重构为单个超分辨率图像。传统的定位显微镜可以在横向维度上进行10~20nm的精确成像，为了实现更高的定位精度，要求显微镜配置具有更高信噪比的灵敏探测器。尽管横向分辨率令人印象深刻，但传统的2D SMLM仍通常缺乏轴向分辨率。

美国Double Helix Optics公司的SPINDLER系列3D显微镜成像模块与3DTRAXR软件相结合，可在三维尺度上实现高精度、亚衍射极限定位，并具有扩展的深度成像能力。SPINDLE采用精密光学器件设计，可与市面上在售的科学显微镜无缝集成，并提供前所未有的横向和轴向精密成像组合。用户可根据具体的应用选择合适的相位掩模版以实现基于深度范围、发射波长和信噪比等参数对点扩散函数（PSF）的优化，更重要的是，SPINDLE可在无需扫描的情况下在单张图像中将传统成像系统的景深扩大10倍。

在本文中，我们展示了如何将SPINDLE成像系统与传统荧光显微镜结合使用以在所有三个维度（x、y、z）上实现亚衍射极限成像。SPINDLE可与任何高质量的科学相机兼容，无论是emccd还是scmos都可以提供定位显微镜所需的高信噪比图像。

使用SPINDLE和DH-PSF相位掩模版对细胞微管进行三维超分辨成像

在本文中，我们证明了使用SPINDLE单通道模块可以实现高精度、大深度的超分辨率重建。如图1所示，使用Double Helix (DH-PSF) 的相位掩模版与SPINDLE单分子定位显微镜组件结合。系统将单个分子发出的光分成两个光瓣，通过找到两个光瓣的中心来检索发光点的横向（x-y）位置；两光瓣之间的角度编码了发光点的轴向（z）位置。这些额外的信息将有助于在横向和轴向尺寸上以非常高的精度（<20nm）进行超分辨率重建。此外，SPINDLE扩展了分子可以定位的景深，这种精确度和扩展深度成像的结合能够以显着提高的z轴分辨率以收集更多的数据。

图1：基于单分子定位显微成像技术（SMLM）技术的带有可互换相位掩模支架的SPINDLE模块

为了演示SPINDLE的工作原理，我们使用NikonN-STORM显微镜结合Photometrics Prime 95B相机对被AlexaFluor 647偶联微管蛋白抗体标记的Cos7细胞进行了成像。对于该样品，我们使用经过优化的相位掩模版，该掩模版可与远红外波长染料和1.49 NA的100倍物镜配合使用。样品在640 nm激光连续照射下在Prime95B上成像，曝光时间为30 ms。使用3DTRAX软件对单发射点进行定位，并将结果导出到ImageJ插件Thun-der STORM。使用归一化高斯方法重建图像，并使用ImageJ查找表“Spectrum”以颜色对z深度进行编码。

图2：单个100nm珠在Prime95B上使用SPINDLE在焦平面（0µm）和焦平面上方（+1µm）和下方（-1µm）微米处的成像图

重建的结果包含超过200万个定位，并显示Cos7细胞中微管的30µmx30µm视野、深度超过2.1µm的范围（图3左）。深度以颜色编码，细胞底部为红色/紫色，顶部附近为黄色/橙色。放大的插图显示微管在一定深度范围内得到了很好的重建（图3，右）。这些数据突出了使用Double Helix SPINDLE模块带来的扩展景深成像和高横向和轴向分辨率。

使用Double Helix 3DTRAX软件进行高精度三维定位

Double Helix 3DTRAX软件是一个ImageJ/FIJI插件，其可以在横向和轴向以亚衍射极限精度定位单个分子。3DTRAX还使用克拉美-拉奥下限(CRLB)5计算了每个定位分子的精度值。该计算基于每个定位的信噪比。

图3：使用SPINDLE(R)和Prime 95B成像的微管三维超分辨率重建图。左图：Cos7细胞免疫染色的微管蛋白，颜色编码深度。右图：左侧图像的放大区域，显示了深度超过2微米的微管。图片由Double Helix Optics提供。平均CRLB值横向约10nm，轴向约20nm（图3）

概括
 

Double Helix的SPINDLE超分辨率3D显微成像模组、相位掩模和3DTRAX软件的组合可实现高精度大深度三维成像、跟踪和计数。在此应用中，我们在亚细胞结构的三维超分辨率重建中展示了大约10nm的横向精度和20nm的轴向精度。SPINDLE系列产品为研究人员提供了强大的工具集，可促进对广泛生物系统中分子结构、亚细胞和细胞内相互作用的理解。

 

图4：横向和轴向精度。用于重建图2所示图像的定位精度值。精度值由3DTRAX软件根据其信噪比使用每个发射器的Cramer-Rao下界5计算得出。定位数显示在y轴上，精度值(nm)显示在x轴上

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关于Double Helix Optics

美国Double Helix Optics是一家位于美国科罗拉多州博尔德的计算光学公司。Double Helix Optics采用其专利的双螺旋光工程成像技术设计开发下一代高精度3D成像产品，广泛应用在生命科学和材料科学领域以实现对亚细胞结构3D的成像、跟踪和计数。

Double Helix的SPINDLE系列成像模块与可切换的相位掩模库以及用于计算重建和分析的软件相结合，确保为我们的客户及其应用的具体情况提供最高质量的3D成像技术。

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