如何去制作一种便携式毛细管实时热对流PCR仪

引言

由于尺寸大，成本高和扩增时间长，传统的 PCR 热循环仪仅限于主要医院和实验室。

最近，通过简化设备结构并减少扩增时间，开发了新平台。一种解决方案是利用温度梯度诱导产生自然对流，从而提升 DNA 的扩增。

当试剂由于自然对流效应而在温度区域之间反复循环时，试剂将在一次循环中经历 PCR 循环的三个步骤 (即核酸变性，退火和延伸)。因此，对流 PCR 可以将扩增时间从数小时缩短到 30-40 分钟。

通过使用这种机制，不需要专用的热循环仪。实时对流 PCR 设备也可以结合荧光检测器来设计。

然而，当前的对流 PCR 系统采用两个或更多个独立的温度控制器，且需要设计特定形状的管子或腔，以使样品液彻底流通。此外，某些操作需要特定的技巧，如从细管中装载和卸载试剂以及密封管的两端而不将气泡困在里面。每一步操作对 PCR 成功扩增都至关重要。

仪器设计

图 1 所示为仪器示意图，该仪器由光源，测量荧光强度的光学系统，用于维持 95℃ 恒定温度的可控热系统组成。采用蓝色 LED 提供 450-520nm 的宽带光作为 DNA 量化实验的光源。

采用 CCD 相机通过 530 nm 光学滤光片来测量 PCR 混合物反射的荧光强度的宽光谱响应。

该机器包含一个半导体制冷器 (thermoelectric cooler) 和一个风扇，分别用于升高和降低外壳温度。将半导体制冷器放置在 铜支架基板和海绵之间以形成加热器件。将热电偶插入半导体制冷器中来确定铜支架基板的温度，以保持 95℃ 的恒定温度。

图 1 仪器图解视图

样品容器采用底部封闭的商用玻璃毛细管( 100ul )。毛细管长 32mm，内径和外径分别为 2.3mm 和 3.2mm。

毛细管在 95°C 的固定温度下从底部加热，在试管内形成温度梯度并产生自然对流，从而引起试剂在毛细管中自发循环，从而完成 DNA 的扩增过程(变性，退火和延伸)。

该项研究采用了乙型肝炎病毒 (HBV) 作为模板 DNA 进行扩增。将 122 bp 的HBV DNA 模板与毛细管中制备的引物相混合。

表 1 列举了所用到的试剂。本文采取高-内径比为 7.7，体积为 75 µL 的毛细管来进行 DNA 扩增。

计算分析

当在毛细管下方加热流体时，底层中的流体颗粒比顶层中的流体颗粒更温暖和更轻。因此，流体的流动有上升的趋势，而粘性力 (viscous forces) 的作用会减慢颗粒的向上运动。这个过程被称为瑞利-贝纳德 (Rayleigh-Bénard) 不稳定性，导致对流运动的产生。

鉴于该过程涉及到的浮力和粘性力，不稳定性受 瑞利数(Ra) 控制，其定义如下：

其中，

   : 重力加速度

  ：流体热膨胀系数 

  ,   : 腔室内 流体顶部(冷)和底部的温度(热)

  : 流体的高度

  : 热扩散率

  : 运动粘度 (kinematic viscosity)

当瑞利数超过临界值时，便会发生对流现象 (不稳定的浮力引起流体在腔室上下表面循环运动)。Ra 是影响对流腔室内流体流动性能 (stream function)，速度和温度分布的关键参数。影响热流体流动的另一个参数是   。其中，  是腔内径。

因为，PCR 扩增效率受试剂和温差影响，因此，只能通过更改腔体高度来更改Ra，而将几何形状作为流量控制的主要参数。

对于 PCR 热循环，因反应在水溶液 (aqueous solution) 中进行，因此其流体性质是恒定的(  、  )。

结果和讨论

图 3 所示，(a) 由瑞利-贝纳德对流控制的模拟温度场。为观察内部流动结构，在去离子水中注入直径为 50um 的聚苯乙烯颗粒 (密度   )可视化的颗粒路径如 3b 所示。 (c) 预测时间和速度轮廓。视频见下 1 。

图 3

在毛细管中，流体的滚动运动使得样品经历退火和延伸，DNA 模板从管顶部掉落并再次加热实现 PCR 循环。模拟和实验结果均表明，单个 PCR 周期大约需要 30 s 。因为完成一个 PCR 流程需要 55-60 个循环，所以预计完成整个 DNA 扩增的总反应时间约为 28min 。

本文采用目标 DNA 片段 (HBV 122 bp) 进行 DNA 定量测量，目标 DNA 的初始拷贝数范围为  拷贝/ uL 至   拷贝/ uL。

 

 

审核编辑：刘清