4D质谱技术深度解析小鼠蛋白质组在性别/年龄水平上的表达差异

在生物医学研究中，动物模型的重要性不言而喻。其中，小鼠是使用较多的模型之一。大多数小鼠在研究时的年龄在4周到20周之间，但是并没有系统性的研究揭示年龄和性别对模型生理和病理的影响，忽略了年龄和性别水平上潜在的分子差异。因此，本文作者利用4D质谱技术深度解析了不同年龄的雌雄小鼠爪部皮肤和坐骨神经的蛋白质表达差异，为临床前研究提供了有价值的蛋白质数据资源。

研究内容

1、DIA-PASEF 可对小鼠爪部皮肤和坐骨神经进行深度可重复的蛋白质组分析 

本研究中，研究者分析了不同年龄（4周和14周）以及不同性别（雄性和雌性）共16只小鼠爪部皮肤和坐骨神经（SCN）的蛋白质组学差异。研究者首先比较了两种labelfree定量蛋白质组检测策略，即DDA和DIA的检测效果。使用混合皮肤多肽和SCN多肽作为质量控制（QC），用DIA模式计算了所有QC样品的pearson相关系数。

混合皮肤和SCN的平均相关性分别为0.98和0.99，表明仪器设置的一致性和稳定性。通常情况下，DIA数据是根据同一样本DDA数据构建的肽文库进行搜索的，因此，只能识别和量化文库中存在的蛋白质。而DIA-NN，一个最近开发的基于深度神经网络的程序，无需构建肽文库而是直接搜索的方式广泛地改进了DIA的分析流程。

研究者使用MaxQuant分析DDA数据，用DIA-NN无文库分析DIA数据并进行比较，发现DIA高度覆盖了DDA的蛋白质鉴定结果，DIA模式下比DDA在皮肤和SCN中检测到额外的4135和3926个蛋白质groups（后文省略groups）。DIA结果的变异系数（CV）更小，表明该模式比DDA重复性更高。因此，研究者使用DIA结果用于进一步研究。

Fig.1 DIA-PASEF在分析小鼠爪部皮肤和SCN蛋白质组时优于DDA-PASEF  

2、小鼠爪部皮肤和SCN中蛋白质丰度的年龄差异

研究者在小鼠爪部皮肤中鉴定到蛋白质超过8600个，包括所有 50 种已知的角蛋白和 19 种胶原蛋白、白细胞介素 (IL) 家族的 13 个成员和 S100 家族的 11 个成员。在SCN中，鉴定到约8400个蛋白质，包含约94%的髓磷脂蛋白质。此外，SCN中还鉴定到离子通道蛋白（如Trpv1等）。

由于离子通道蛋白丰度较低及其疏水性很难被质谱检测到，侧面表明Tims TOF DIA检测蛋白质的深度和高性能。主成分分析（PCA）将样品按年龄区分开，无论是在爪部皮肤还是SCN中，这说明年龄是一个突出的鉴别因素。对鉴定到的蛋白质进行模糊C均值聚类分析发现大多数蛋白质表达模式与年龄具有强关联性，一部分蛋白质在年龄／性别组中表现出不同的表达趋势。

例如，皮肤蛋白质组cluster 6中的大多数蛋白质在雌性中显示出轻微的年龄依赖性变化，而与4周龄雄性相比，14周龄雄性的丰度显著增加。这些结果表明，爪部皮肤和SCN的部分蛋白质表达模式存在性别和年龄的特异性，这可能会影响小鼠的生理/病理状态。

Fig.2 爪子皮肤和SCN蛋白质组的年龄和性别差异   

3、爪部皮肤中生物学通路的年龄与性别差异

为进一步探究蛋白表达与年龄的相关性，研究者筛选了|log2FC>=0.585|且q-value<=0.05的蛋白质作为差异蛋白（DEP），在雌性和雄性的结果中各找到234和94个皮肤DEP，其中46个同时存在于2个性别组中。对这46个DEP进行GO富集分析（BP方向）发现了3个显著的条目。

与14周相比，4周的皮肤组富集了与皮肤发育相关的途径，如“蛋白质羟化”和“胶原纤维组织”，几种脯氨酸/丝氨酸羟化酶和胶原蛋白成员在4周组中上调表达。对雄性和雌性组的DEP分别进行GO-BP富集分析发现，在雄性皮肤中，“缺口信号”和“外在凋亡信号”条目在4周时显著丰富，而“肌动蛋白介导的细胞收缩”和“参与形态发生的细胞成分组装”在 14周时显著丰富。在雌性皮肤中，与4周相比，14周时显著富集了多个有助于皮肤稳态的条目。

Fig.3 爪部皮肤样本的差异表达分析揭示了雄性和雌性小鼠不同的年龄相关的生物学通路   

4、SCN 中免疫通路和髓磷脂蛋白的年龄与性别差异 

在雌性和雄性SCN中，根据年龄进行差异比较分析，各发现929和1269个DEP。通路富集分析发现，在两种性别中的共有DEP中，“囊泡定位”在4周的Z分数更高，而与“神经元存活”、“神经递质运输”和“顺行轴突运输”相关通路在14周更显著。

在SCN结果中，搜索已知在免疫细胞中表达的神经元受体的配体蛋白表达情况，发现有19个蛋白在两种性别中都表现出与年龄相关的丰度差异。研究者根据这些结果提出一个假设，即在年幼小鼠的SCN中存在一种特殊的动态平衡机制，可在受体水平上平衡配体的丰度。

髓鞘蛋白质中有21种的丰度受年龄调节，包括高丰度的结构髓鞘蛋白，如MBP和MPZ。MBP和MPZ在14周的雄性和雌性SCN中都上调表达，反映了髓鞘组装和轴突随年龄的发育。然而，一些与年龄相关的髓鞘DEP是性别特异性的。进一步研究这些与性别和年龄相关的变化可能有助于更好地了解髓鞘的分子结构以及相关的病理。

Fig.4 不同年龄SCN样品的差异表达分析  

5、不同年龄组爪部皮肤和SCN蛋白质组的性别二态性

接下来，研究者研究了4周和14周时雄性和雌性组的蛋白质表达差异，并在皮肤和SCN中分别找到58个和33个DEP，并且它们在4周和14周的性别差异有明显不同。与14周相比，4周的变化不明显。在4周的SCN中没有找到任何DEP。GO-BP富集分析发现在14周皮肤和SCN的性别比较结果中，“补体激活调节”显著富集。补体系统与免疫、宿主防御、炎症和相关病理学密切相关，因此，这种性别二态性会为今后的研究，特别是使用啮齿动物疾病模型的实验设计提供重要指导。

Fig.5 差异表达分析揭示爪部皮肤和SCN中蛋白质特征的性别差异  

6、与皮肤病和疼痛相关的多种蛋白质具有年龄与性别差异 

研究者将人皮肤病转录图谱数据库中的数据反向翻译成小鼠数据，并和自己的结果进行比较，找到了907个致病基因中的329个。其中27个蛋白质表现出显著的年龄和/或性别差异。对这329个皮肤病相关蛋白的聚类分析不仅揭示了年龄和性别组之间的离散丰度模式，而且当比较四个组时发现了不同表达模式的蛋白质。

Cluster6的蛋白质在14周的雄性皮肤丰度更高；而与14周相比，cluster7的蛋白质在4周的皮肤中丰度较低。转录因子 Sp1 (Sp1) 和多功能蛋白聚糖核心蛋白 (Vcan) 在4周雌性皮肤的丰度较低（与14周雌性相比）。转化生长因子-β诱导蛋白 ig-h3 (Tgfbi) 和Sp1在 14 周的雌性皮肤中丰度更高，但在雄性中没有发现类似的显著差异。这些结果表明，人类皮肤病相关蛋白的表达在小鼠中受到年龄和性别影响，这对皮肤反向翻译研究具有极其重要的意义。

SCN 受到各种病理的影响，例如神经损伤和神经性疼痛，在这种情况下，研究者通过与三个公开可用的疼痛基因数据库进行比较，评估了 SCN 数据集中已知疼痛相关基因的蛋白表达水平。在 841 个疼痛基因中，有 245 个在我们的 SCN 蛋白质组中被定量检测到，并且这245个疼痛相关蛋白的丰度分布因年龄和/或性别而异。

血管紧张素转换酶(Ace)表现出明显的年龄和性别差异，而其家族成员Ace2只显示出年龄差异(即在成年小鼠中表达较高)。FK506结合蛋白51(Fkbp5)也显示出显著的年龄和性别差异，与4周小鼠相比，其在雌性成年小鼠中的表达较低，而在雄性成年小鼠中的表达较高。这些结果表明蛋白质丰度在不同年龄和性别中的变化对于临床前疾病模型研究的重要性。综上所述，本研究的数据结果强调了性别与年龄匹配的平行性生物医学研究的必要性。

Fig.6 与皮肤病和疼痛相关的多种蛋白质表达受年龄和/或性别影响  

结果总结

本研究采用优化的定量蛋白质组学研究方法，深入剖析小鼠爪部皮肤和SCN这两个组织与伤害性和疼痛，以及与炎症、损伤和脱髓鞘相关疾病的关系。研究者的分析揭示了与小鼠年龄和/或性别相关的蛋白质亚群和网络，其中包括已知的(病理)生理相关的蛋白质/生物通路，比如皮肤中的动态平衡和表皮信号，以及在SCN中，多髓鞘蛋白和神经元发育的调节因子。

与现有数据库比较发现，与皮肤病和疼痛相关的多种蛋白质表达水平显著受到年龄和/或性别影响，揭示了蛋白质和蛋白质网络水平上迄今未知的性别和年龄差异。

审核编辑：刘清