双光子激发荧光显微成像原理

双光子吸收效应在量子光学领域是一个历史悠久的理论，1931年由Maria Göppert-Mayer在她的博士论文中提出。直到1990年底，锁模激光器的出现才通过实验验证双光子吸收现象。

在这一时期，康奈尔大学Webb实验室是第一个使用双光子显微成像技术来观察活细胞中的染色体；1994年从这个实验室出来的德国科学家Winfried Denk最早将双光子技术应用在神经科学领域。

之后，美国科学家Karel Svoboda在1997年成功用双光子成像观察了小鼠脑中的神经细胞。时至今日，双光子显微系统在神经科学领域有了极大的发展，近年来，光遗传光刺激也更多地和双光子技术结合，广泛地应用于清醒小动物。

在传统激光共聚焦显微镜中，光通过处的所有样品都被激发，所以必须用孔径光阑来选取焦点处样品发出的荧光。孔径光阑不仅遮挡了焦点以外样品发出的荧光，而且也遮挡了焦点处散射和漫反射的荧光。

多光子显微镜常称作非线性、双光子激光扫描显微镜，是建立在先进的超快脉冲激光扫描技术基础上的显微镜实验方法，在更深入的层面上提供了更优秀的光学切片能力。

荧光分子同时吸收两个长波长的光子到激发态，在经过一个很短的所谓激发态寿命的时间后，发射出一个波长大于激发光波长一半的较短的光子，从而实现成像。

这种技术需要超快激光器，由于其具有非常高的峰值功率和较低的平均功率，从而可以减小或者消除光漂白和光毒作用。多光子的吸收现象是非线性效应，只发生在聚焦焦点处，不需要共聚焦孔径光阑滤光，从而大大提高成像亮度和信噪比。

在过去的二十年中，钛：蓝宝石激光器是许多机构多光子应用的主力光源。因为他们提供的波长可调谐，具有非常高的飞秒激光脉冲输出功率。

由于钛：蓝宝石激光器具有极其复杂和极具挑战的调试校准过程，现在锁模的光纤飞秒激光器在多光子显微镜中成为极具吸引力的光源。Toptica的光纤飞秒激光器可提供广泛的波长选择方案，这些激光具有非常高的脉冲峰值功率和较低的平均功率，在持续运转上不需要额外的维护和任何水冷设备。另外，我们采用的SAM被动锁模，具有优秀的模式稳定性和更高的性价比。

Toptica的FemtoFiber Pro型号从一个孔径发射亚100fs 脉冲，输出波长780nm（>100mW）和 1030nm（>200mW），可独立调制强度、脉宽（啁啾）以及相应的脉冲间延迟，这些可调节的参数在活体细胞多色双光子成像、宽带相干反斯托克斯拉曼光谱（CARS）、受激拉曼光谱（SRS）研究，以及泵浦-探测实验和脉冲受激发射耗尽（STED）显微应用中，能够大显身手。我们的飞秒光纤激光器可提供波长在1µM以上的激光，这些激发光束受散射影响较小更容易穿透标本，对活性标本的杀伤极小，因此非常适用于活细胞成像，尤其是厚的活组织如脑片、胚胎、整个器官甚至整个机体的成像研究。

Toptica光纤激光器将来会成为多光子等先进的显微技术的主力，如双光子、宽带拉曼和其他时间分辨的应用等。光纤激光器具体参数如下图：

应用示例：

双光子成像系统简图

受体神经元轴突，使用钛：蓝宝石激光器和我们的光纤飞秒激光器FemtoFiber pro NIR的双光子成像对比图

海马体回CA1锥体神经元使用Fluo-4和Alexa 594标记试剂填(~50 µm 深)，使用FemtoFiber pro NIR和Femtonics Femto2D显微镜成像，目标后孔的平均功率为10mW。