WB，IP，IHC，IF，ChIP，FC抗体能通用吗？

疑问：

查询抗体的时候，发现在抗体应用栏中，有的抗体适用于WB、IP、IHC、IF、F、CHIP等所有实验，而有的抗体适用于WB、IHC、IF、F，不适用于IP和CHIP?科研人员都倾向使用一种抗体将预计的实验做完，避免去寻找其它抗体，所以首选能通用抗体。

而上一篇《WB，IP，IHC，IF，ChIP，FC抗体的区别?》提出WB，IP，IHC，IF，ChIP，FC抗体为什么不能通用?其中WB抗体是识别线性抗原表位的抗体，而其它方法学需要针对识别构象抗原表位的抗体。这就导致WB抗体不适用其他方法学。

疑问出现：一会说首选能通用的抗体，一会又说抗体为什么不能通用。这究竟是怎么回事?

 

为了解释上面提到的疑问，首先需要了解决定抗原特异性的抗原表位;同时了解抗体的两种分类：单克隆抗体和多克隆抗体。

抗原特性：

抗原的特异性是免疫学检测、诊断及防治的分子基础和理论依据，而决定抗原特异性的结构基础就是存在于抗原分子中的抗原表位(epitope)。根据抗原表位的空间结构特点可将其分为顺序表位(sequential epitope)和构象表位(conformational epitope)。顺序表位由肽链上一段序列相连续的线性氨基酸残基所构成，又称线性表位。顺序表位存在于抗原分子的任意部位。构象表位由多肽或多糖链上空间位置相邻，而序列上不相连续的氨基酸或多糖残基所构成。

抗体分类：

单克隆抗体(monoclonalantibody，mAb)是由单一B细胞克隆产生的高度均一、仅针对某一特定抗原表位的抗体，称为单克隆抗体。通常采用杂交瘤技术来制备，杂交瘤(hybridoma)抗体技术是在细胞融合技术的基础上，将具有分泌特异性抗体能力的致敏B细胞和具有无限繁殖能力的骨髓瘤细胞融合为B细胞杂交瘤。

多克隆抗体(polyclonal antibody， pAb)：用一种包含多种抗原决定簇的抗原免疫动物，可刺激机体多个B细胞克隆，相应地就产生针对多种抗原表位的多种单克隆抗体，所获得的免疫血清实际上是含有多种单克隆抗体的混合物，即多克隆抗体。

如果制备抗体的抗原，既含有线性抗原表位，又含有构象抗原表位，并且抗体识别的抗原表位和该蛋白质与目标物质结合的部位不一致的情况下，同时以多克隆形式呈现的抗体，那么此抗体就有可能成为通用抗体(具体还得以实验数据为准，因为抗体研发出来之后都要经过WB，IP，IF，IHC等实验验证才能最终确认其适用范围)。

另外，如果抗体识别的抗原表位和该蛋白质与目标物质结合的部位一致的情况下，则会导致Co-IP，CHIP实验的失败。这也就出现前面疑问提到：有的抗体适用于WB、IHC、IF、F，不适用于IP和CHIP。

如果制备的抗体的抗原只含有线性抗原表位，那此抗体通常情况下只适用于WB实验。因为其他方法学的目标蛋白一般无需经过变性处理，需要用抗体去识别天然状态下的蛋白质，目标蛋白可能既含有线性抗原表位，又含有构象抗原表位，如果线性抗原表位暴露在蛋白质表面，没有包裹在蛋白内部而无法识别，那此时的WB抗体也有可能适用其他方法学。

有的实验为了特异性，选择单克隆抗体，那此时抗体的适用范围就会变窄。但也有特殊情况，例如图一中Rb(4H1)Mouse mAb(9309)，此抗体为单克隆抗体，但是经过实验验证，发现其居然适用WB、IP、IHC、IF、F、CHIP等所有实验。推测此抗体的抗原只含有线性抗原表位，并且抗原表位暴露在蛋白质表面，没有包裹在蛋白内部而无法识别，那这个抗体就有可能适用上述提到所有方法学实验，在适用范围验证过程中也恰好证明如此。

综上，一个抗体的适用范围是由抗原决定簇决定的，包含线性抗原表位或者构象抗原表位;抗体识别抗原表位是否影响该蛋白与目标物质的结合;同时又取决于抗体是单克隆抗体或者多克隆抗体。

单克隆特异性好，应用范围有限;多克隆抗体犹如多种单克隆抗体的混合物，它们有的特异性高，有的特异性低，总体特异性符合正态分布曲线的形式，适用范围更广。但是具体到使用单抗还是多抗，则需要具体问题具体分析。比如检测的蛋白浓度低，用多抗检测到的可能性会比单抗高。又或者待检测蛋白被分割成两段，那就需要针对识别两段抗原表位的多抗。

题外：

关于假阳性

根据抗体最核心的表位结合区域—互补决定区(Complementarity Determining Region，CDR)的结构，抗体通常可以紧密结合的抗原表面区域或表位面积很小，对于变性的肽段约在4-8个Aa以内，以及5-7个单糖的糖链或6-8个核苷酸的核酸。通过肽段BLAST可以得知，小肽段序列完全相同的情况将在很多不同蛋白上发生。这意味着单抗识别的这个表位可能并不仅仅属于靶标蛋白本身，也即意味着，即使利用纯化抗原蛋白进行了特异性筛选的单克隆抗体，当用其检测复杂样本时，也将面临交叉反应或假阳性问题。

灵敏度

特异性决定了假阳性结果的多少，敏感性决定了检出率的高低。在复杂样本中，由于多克隆抗体识别抗原的多个表位，可以在一个抗原分子上结合更多的抗体分子，也可以在当部分抗原表位受到一定程度的遮盖或破坏时，仍有抗体结合在未受影响的表位上。这种情况常发生在如石蜡包埋的免疫组化(IHC-P)等实验中，当样本经甲醛交联固定后，即使经过抗原修复，抗原表位也不可避免地受到了影响，此时单克隆抗体由于只识别一个表位，结合能力可能大大降低甚至呈现阴性结果，而只要不是所有表位都受到了破坏，多抗仍可以获得该靶点的阳性结果。同样的，对于样本中一些表达丰度极低的蛋白，由于多表位结合更多抗体分子，检测信号就将被放大。因此，使用多抗具有灵敏度和检出率上的优势。