纯相位空间光调制器在PSF工程中的应用

 一、引言 

 

2014年诺贝尔化学奖揭晓，美国及德国三位科学家Eric Betzig、Stefan W. Hell和William E. Moerner获奖。获奖理由是“研制出超分辨率荧光显微镜”，从此人们对点扩散函数 (PSF) 工程的认识有了显著提高。

Moerner 展示了 PSF 工程与 Meadowlark Optics SLM 的使用案例，用于荧光发射器的超分辨率成像和 3D 定位。PSF工程已被证明使显微镜能够使用多种成像模式对样本进行成像，同时以非机械方式在模式之间变化。这允许对具有弱折射率的结构进行成像，以及对相位结构进行定量测量。已证明的成像方式包括：螺旋相位成像、暗场成像、相位对比成像、微分干涉对比成像和扩展景深成像。

美国Meadowlark Optics 公司专注于模拟寻址纯相位空间光调制器的设计、开发和制造，有40多年的历史，该公司空间光调制器产品广泛应用于自适应光学，散射或浑浊介质中的成像，双光子/三光子显微成像，光遗传学，全息光镊(HOT)，脉冲整形，光学加密，量子计算，光通信，湍流模拟等领域。其高分辨率、高刷新率、高填充因子的特点适用于PSF工程应用中。

 

二、空间光调制器在PSF工程中的技术介绍

 

在单分子定位显微镜（SMLM）中，通过从相机视场中稀疏分布的发射点来估计单个分子的位置，从而克服了分辨率的衍射限制。可实现的分辨率受到定位精度和荧光标签密度的限制，在实践中可能是几十纳米的数量级。有科研团队已经将这种技术扩展到三维定位。通过在光路中加入一个圆柱形透镜或使用双平面或多焦点成像，可以估算出分子的轴向位置。光斑的拉长（散光）或光斑大小的差异（双平面成像）对轴向位置进行编码。将空间光调制器（SLM）与4F中继系统结合到成像光路中，可以设计更广泛的点扩散函数（PSF），为优化显微镜的定位性能提供了可能。

利用空间光调制器（SLM）对荧光显微镜进行校准，可以建立一个远低于衍射极限的波前误差，SIEMONS团队就利用Meadowlark空间光调制器实现了高精度的波前控制。原理证明和实验显示，在1微米的轴向范围内，在x、y和λ的精度低于10纳米，在z的精度低于20纳米。对这篇文献感兴趣的话可以联系我们查阅文献原文《High precision wavefront control in point spread function engineering for single emitter localization 》

下面我们来具体看看是如何应用的，以及应用效果如何。

图2. A）SLM校准分支和通过光路的偏振传输示意图。额外的线性偏振滤波器没有被画出来，因为它们与偏振分光器对齐。B）相机上的强度响应作为λ/2-板不同方向α的SLM的相位延迟的函数。C) 光学装置的示意图。一个带有SLM的中继系统被添加到显微镜的发射路径中（红色），一个单独的SLM校准路径（绿色）被纳入发射中继系统中。这允许在实验之间进行SLM校准。BE：扩束器，DM：分色镜，L：镜头，LPF：线性偏振滤镜，M：镜子。OL：物镜，PBS：偏振分光镜，TL：管镜。

光路如上图2所示，包括一台尼康Ti-E显微镜，带有TIRF APO物镜（NA = 1.49，M = 100），一个200毫米的管状镜头，一个带有SLM的中继系统被建立在显微镜的一个出口端口。中继系统包括两个消色差透镜，一个向列型液晶空间光调制器（LCOS）SLM（Meadowlark，XY系列，512x512像素，像素大小=15微米，设计波长=532纳米）和一个偏振分光器，用于过滤未被SLM调制的X偏振光。第一个消色差透镜在SLM上转发光束。

第二个中继镜头确保在EMCCD上对荧光物体进行奈奎斯特采样。显微镜配备了一套波长为405nm、488nm、561nm和642nm的合束激光器。

这个配置增加了一个用于校准SLM的第二个光路。这个空降光调制器校准光路是为测量入射到SLM上的X和Y偏振光之间的延迟差而设计的，为了测量某个SLM像素的调制，需要将SLM映射到校准路径的相机上。这种映射是通过在SLM上施加一个电压增加的棋盘图案来获得的。平均捕获的图像和没有施加电压时的图像之间的差异被用作角落检测算法（来自Matlab - Mathworks的findcheckerboard）的输入，以找到角落点。对这些点进行仿生变换，并用于找到对应于每个SLM像素的CMOS像素。

 

图3. SLM校准程序。A) 单个SLM像素的测量强度响应作为应用电压的函数。每一个极值都对应于等于π的整数倍的相位变化，并拟合一个二阶多项式以提高寻找极值的精度。强度被分割成四个部分，它们被缩放为[0 1]。这个归一化的强度（B）被转换为相位（C），并反转以创建该特定电压段和像素的LUT（D）。E）20个随机选择的SLM像素的归一化强度响应，显示像素间的变化。F) 测量的波前均方根误差是校准后立即使用校准LUT的相位的函数，45分钟后，以及制造商提供的LUT。G) 在不同的恒定相位下，用于成像光路的SLM部分的LUTs。暗点表示没有3个最大值的像素。H) 测量的平均相位和预定相位之间的差异作为预定相位的函数。

 

图3解释了SLM像素的校准程序。首先，以256步测量作为应用电压函数的强度响应，产生一连串的最小值和最大值，它们对应于π或2π的迟滞。在被照亮的SLM平面内的所有像素似乎有三个最大值，这意味着总的相位调制为4π或1094纳米。这些极值出现的电压是通过对极值附近的三个点进行拟合抛物线来找到的，这增加了精度，并充分利用了SLM的16位控制。然后，强度被分为四段，用公式（11）的逆值对这些段进行缩放并转换为相位。相位响应被用来为每个SLM像素构建一个单独的查找表（LUT），以补偿SLM的非均匀性。LUT参数在SLM上平滑变化，并与肉眼可见的法布里-珀罗条纹大致对应，表明相位响应的差异是由于液晶层厚度的变化造成的。额外的像素与像素之间的变化可能来自底层硅开关电路的像素与像素之间的变化。完整的校准需要大约5分钟（在四核3.3GHz i7处理器上的3分钟扫描和2分钟计算时间），但原则上可以优化到运行更快。

 

实验结果：

图4 测量的PSF与矢量PSF模型拟合之间的PSF比较。G-I）平均测量的PSF是由大约108个光子携带的信号通过上采样（3×）和覆盖所有获得的斑点编制而成。比例尺表示1μm。

 

图4显示PSF模型的预测结果。通过这种方式，实验的PSF是由∼108个光子的累积信号建立起来的。实验和理论上的矢量PSF之间的一致性通常是非常好的，甚至在最大的离焦值的边缘结构也是非常匹配的。剩下的差异，主要是光斑的轻微变宽，是由于入射到相机上的光的非零光谱宽度，由于发射光谱的宽度和四带分色器的带通区域的宽度。边缘结构中也有一个小的不对称性，这可能是由光学系统中残留的高阶球差造成的。

所有工程PSF的一个共同特点是，与简单的二维聚焦斑点相比，它们的复杂性必须在PSF模型中得到体现，该模型被用于估计三维位置（可能还有发射颜色或分子方向）的参数拟合算法。简化的PSF模型，如高斯模型、基于标量衍射的Airy模型、Gibson-Lanni模型，或基于Hermite函数的有效模型都不能满足这一要求。一个解决方案是使用实验参考PSF，或用花样拟合这样的PSF作为模型PSF，或者使用一个或多个查找表（LUTs）来估计Z-位置。矢量PSF模型也可以用于复杂的3D和3D+λ工程PSF。众所周知，矢量PSF模型是高NA荧光成像系统中图像形成的物理正确模型。复杂的工程PSF的另一个共同特点是对扰乱设计的PSF形状的像差的敏感性，并以这种方式对精度和准确性产生负面影响。为了实现精确到Cramér-Rao下限（CRLB），即无偏估计器的最佳精度，光学系统的像差水平应该被控制在衍射极限（0.072λ均方根波前像差），这个条件在实践中往往无法满足。因此，需要使用可变形镜或为产生工程PSF而存在的SLM对像差进行校正。自适应光学元件的控制参数可以使用基于图像的指标或通过测量待校正的像差来设置。后者可以通过基于引入相位多样性的相位检索算法来完成，通常采用通焦珠扫描的形式。这已经在高数值孔径显微镜系统、定位显微镜中实现，并用于提高STED激光聚焦的质量。

 

 

 

三、PSF应用对液晶空间光调制器的要求
 

 

1

光利用率

对于这个应用来说，SLM将光学损失降到最低是很重要的。PSF工程使用SLM来操纵显微镜发射路径上的波前。在不增加损失的情况下，荧光成像中缺乏信号。使用具有高填充系数的SLM可以最大限度地减少衍射的损失。

Meadowlark公司能提供标速版95.6%的空间光调制器，分辨率达1920x1200，高刷新率版像素1024x1024，填充因子97.2%和dielectric mirror coated版本（100%填充率）。镀介电膜版本的SLM反射率可以做到100%，一级衍射效率可以做到98%。高分辨率能在满足创建复杂相位函数的同时，能够提升系统的光利用率。

 

 

2

刷新率（最高可达1K Hz）

高速度可以实现实时的深层组织超分辨率成像。可见光波段最高可达1K Hz刷新速度（@532nm）。

3

分辨率（1920x1200）

高分辨率的SLM是创建三维定位所需的复杂相位函数的理想选择，如此能够对每个小像元区域的光场进行自由调控。