虹科技术丨头脑风暴 (下)

 

继上篇结尾：

——Roukes将其比作功能磁共振成像（fMRI），一种目前用于对整个大脑进行成像的类似技术。他说："fMRI扫描中的每个体素，或三维像素，通常约为一立方毫米的体积，包含大约10万个神经元。因此，每个体素代表了所有这10万个细胞的平均代谢活动。综合神经光子学的首要目标是实时记录这10万个神经元集合中的每个神经元正在做什么。

 

 

高分辨率

High Resolution

 

这意味着研究人员现在可以在高度散射的神经组织中实现神经元活动的密集功能成像，在任意深度提供细胞尺度的分辨率。

 

Caltech高级研究科学家Moreaux说："我们的方法是通过在三维空间晶格上分布密集的微尺度光子发射器和探测器像素阵列，从而于在大脑中植入整个无透镜的成像系统。这些像素阵列被集成到狭窄的硅柄上，结合了硅纳米探针制造的最新发展结果。配合功能性分子报告器和光遗传驱动器，这种新型装置展现了讯问小鼠大脑皮层的10万个神经元的所有神经活动的前景。

 

Roukes表示，该团队的长期目标是传播集成神经光子学的先进仪器，以实现多机构合作，利用这种新技术开拓先进的神经科学研究。以前，这种神经技术的开发主要依靠单个实验室或调查员领导的研究。

 

大脑计划背后的团队走到一起，为神经科学研究带来了大规模的合作，以前的物理科学中也是如此的。Roukes说，现在，综合神经光子学为这种仪器建设团队合作开了一扇门。他说："许多构建模块已经存在了十年或更久。但是，直到最近，还没有人有这样的眼光、意愿和资金来把它们放在一起，实现这些强大的神经科学工具。

 

例如，就如Moreaux所说，为了使神经光子探针的光发射器在组织内进行微光束传输，研究人员必须促进从现有的红外光子学电路范式（广泛用于电信应用）向可见光子学电路的转变。"更具体地说，用蓝光，以适配荧光生物标志物的激发光学光谱。我们在加州理工学院的Kalvi Nanoscience Institute（KNI）的洁净室开展了这项工作，并与我们在法国Leti-CEA和新加坡AMF的合作伙伴一起推进。"当然，开发由红外线激活的光遗传执行器，这种"反向 "努力也为使用红外线光子学电路提供了进一步的可能性。值得注意的是，近红外光遗传执行器的开发近来发展势头很好。

 

突破

Breakthrough

 

最近，在分子报告器方面的一些突破可以实现多模式和多物理感应。同样，光遗传执行器能够对神经活动进行光学控制，以及通过基因编码影响传递分子报告器和提供细胞类型特异性的执行器的。

 

在挑战方面，特别是涉及到硬件时，Moreaux觉得一个关键的技术挑战是将光传输和光子传感器整合在同一芯片上，并采用可植入的形状因素（硅柄）。'换句话说，就是一种既能传递图案化的脉冲光又能进行光子检测的集成技术，如CMOS和光子学电路（硝酸硅）的集成。

 

如果该技术要被广泛采用，该技术的大规模生产能力将是至关重要的。因此，Moreaux说，另一个挑战是，这种集成能力不仅必须在小规模的概念验证中实现，而且还必须在代工规模上实现。此外，由于集成神经光子学使用光来引导神经元活动的电信号，如果该技术要用于绘制大脑电路和其他应用，光学报告器方面的开发也是至关重要的。

 

莫罗说："虽然在过去十年中，光遗传报告器(荧光团)领域肯定有很多进展，但为了在综合神经光子学的背景下优化其使用，有一些挑战需要考虑。例如，对报告器表达的空间密度进行更精细的控制：密度太高，你就失去了分离神经元的能力，密度不够，你就无法充分利用该技术。

 

当然，除了技术上的挑战，开发这种类型的技术所需的投资也是一个巨大的障碍。莫罗说："对这种类型的投资的买入，更有可能在有更大机会获得更大的实际投资回报的领域获得驱动力，例如在临床领域。

 

尽管有这样一些挑战，Moreaux认为该方法是可计量的。他说："我们可以铺设多个模块，以密集地覆盖大脑深处的扩展区域。我们预计，这将最终允许讯问--在大脑的任意位置和深度同时记录和模式化刺激数百万个神经元--以单细胞的分辨率和细胞类型的特异性来揭示神经网络的动态。

 

莫罗说，通过与代工伙伴的合作，人们实现了在如可见光波长集成纳米光子学的低损耗晶圆级的大规模生产过程上的历史性突破。这反过来又允许在脑组织中演示相干光束的形成；实现微发射器的光束稳定相位阵列的构成和微发射器探针阵列的选择性平面照明；以及创建可植入的、角度可选择的单光子微探测器阵列。

 

莫罗说："这些构成了具有微观尺寸的完整植入式可见光波长功能成像系统的基本构件。此外，我们通过开发和实施计算方法来评估散射介质中的荧光光子产量，验证了集成光子学范式的基础物理学。有了这些工具，我们已经验证了我们的计算方法，以进行光源分离和定位，从而能够确定实用的、可实现的架构，能够在深度上实现密集的体积活动重建。

 

这些系统是基于现有电子和光子芯片代工厂已经常规应用的大规模生产过程。莫罗认为，像这样的行业伙伴关系，对于使这项工作成为商业现实至关重要。他解释说："与混合光子学和CMOS制造技术代工伙伴的合作，对于共同整合植入式硅柄上的不同技术功能块将是非常重要的。同样，拥有后处理和光电封装专业知识的行业伙伴也是如此。我们已经与CEA-Leti和AMF，以及IBM和台积电在CMOS芯片制造方面进行了合作。

研究小组认为，所有这些发展和行业的伙伴关系共同验证了集成神经光子学的潜力。

 

 

虹科伙伴之声

Lumencor Insights

 

 

虹科伙伴Lumencor的技术工程师Iain Johnson就过去15年里发展的光遗传学技术表达了看法，这些技术是神经科学家们称手的工具，提供神经网络以功能复杂性的光谱和空间分辨率数据，同时避免使用历史上无处不在的微电极进行直接的物理讯问。光遗传学使用非破坏性的照明来处理细胞和细胞功能，而不是使用侵入性电极。遗传学 "指的是光激活离子通道蛋白的转基因表达，需要将光输入转变成感兴趣的细胞中的电活动。

 

图1：示波器记录了由Spectra X光引擎的TTL触发产生的485nm（0.5ms脉宽）和560nm（3ms脉宽）交替输出脉冲。两个叠加的示波器轨迹显示，其中485nm的强度通过RS232串行命令从100%调整到55%，而560nm的强度保持不变。485nm和560nm脉冲的时间间隔是~0.25ms

 

 

虹科Spectra X光引擎

 

用于光遗传学刺激的照明源必须在光谱、空间和时间输出特性方面满足某些要求。本文考虑的这些特性与基于固态LED和激光的光引擎的性能有关。

 

光遗传学主要的光谱输出要求是光引擎的光谱输出与可光激活的离子通道蛋白的作用光谱的最大交集。目前，最常用的光谱输出是475nm，用于刺激channelrhodopsin（ChR2），575nm用于抑制halorhodopsin（NpHR）。基于LED的光引擎提供的光谱输出在时间上是不连续的（图1），但在空间上是重合的。额外的光谱输出有利于使用新的光蛋白，并为荧光标记和电压敏感的染料提供激发，与光遗传刺激或抑制并行：例如，1. 通过使用近红外（>700nm）光刺激，可以达到更深的组织渗透。2. 通常的做法是使用黄色荧光蛋白（YFP）的共同表达，以便通过荧光显微镜确定ChR2的位置。3. 选择YFP是因为它的荧光激发（510nm）与ChR2的光刺激（475nm）有足够的波长间隔，这两个过程可以独立启动。

 

对于大脑切片或培养的神经元制剂的体外实验，基于LED的光引擎与荧光显微镜相配合，提供了适合同时刺激数千个神经元的宽场照明。对于ChR2的刺激，在样品平面上需要1mW/mm2的辐照度阈值，这个水平是用于传统荧光显微镜的低端范围。空间选择性的照明可以通过添加数字微镜设备(DMD)来产生。

 

对于单个细胞的选择性刺激，需要能聚焦到衍射有限的光斑尺寸<10µm的激光器。体内实验提供了额外的能力来观察光遗传刺激引起的复杂行为结果。光通常通过直径为200µm的多模光纤传输，连接到植入动物大脑的插管上。与LED相比，激光在这些光纤中具有更好的耦合效率，因此是体内光遗传学的首选光源。

 

神经元的电活动是在毫秒级的时间范围内被调制的。因此，用于光遗传学刺激的照明源必须具有相同时间尺度的光学调制能力（图1）。Kubota和同事最近发表的一篇文章充分利用了虹科Spectra X光引擎提供的时间和输出功率控制，对表达ChR2的大鼠背根神经节（DRG）神经元进行了光刺激。记录了恒定强度下不同的光脉冲持续时间（0.1至10ms）和恒定脉冲宽度下不同的刺激强度（2至78mW）的影响。 

此外，用一对0.5ms的脉冲隔开5至20ms的不同间隔进行刺激，以评估ChR2脱敏的效果。

 

总的来说，光遗传学和传统电刺激的定量比较结合，为以前不熟悉光遗传学技术能力的读者提供了一个有用的参考点。

 

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什么是荧光分子报告器（Fluorescent molecule reporter）

又称荧光蛋白/报告分子，为测量单个细胞或细胞群的基因表达的工具。；如GFP, CFP, YFP, mCherry...

 

  

什么是光遗传学执行器（Optogenetic actuator）

一种可改变细胞活动的蛋白质。当暴露于光照时，其就会表达。这些致动器可以用来诱导单个或多个动作电位（可以组织成有规律的尖峰序列，也可以以用户控制的速度进行伪随机），抑制神经活动，或修改生化信号通路，对事件的时间进行毫秒级控制。如ChR2, IC1C2, eNpHR等