光学显微镜中生物细胞的温度控制面临的挑战和解决方案

 

众所周知，温度的变化对化学反应速率和生物机理都会产生影响，如何精准地控制“实验温度”以及研究不同温度下的实验样本状态尤为重要。因此，我们从成像样品温度控制面临的常见问题出发，致力于实现对显微镜视野中的温度进行高灵敏度的热控制，由此获得更严谨可靠且可重复的数据。

 

显微镜中温度控制问题：

1.液体样品蒸发 - 介质浓度变化，在较冷表面凝结；

2.温度漂移；

3.温度范围有限（最大 45–55°C），标准控制系统中无法实现快速温度变化；

4.在较高温度下图像质量下降或 TIRF 角度损失；

5.某些设置的复杂性——多个反馈回路，需要特定的温度校准；

6.不同的温度和整个视场的温度梯度 - 作为散热片的浸泡物镜。

 

图 1：a) 使用 63x/1.4 NA 油浸物镜时的散热效果表征。平衡至 37°C 的大型环境室不足以将样品保持在 37°C。当浸入式物镜接触样品时，温度至少降低 3°C，并且永远不会回到 37°C，因为物镜连接到显微镜主体，显微镜主体在室温下位于腔室外部。VAHEAT 用于表征温度下降并补偿物镜的冷却效果。开启 VAHEAT 后，热沉效应仅在前 10 秒内出现，当温度降至 36.2°C 时，仪器反馈回路会对其进行校正。这样，样品始终精确地保持在 37°C。b) 旋转圆盘共焦装置光学成像中心 Erlangen，数据采集地。

 

二►

显微镜温度控制的常规解决方案：

传统的温度控制解决方案没有一种设备可以完美地适合每个对温度敏感的实验，往往需要根据特定的应用为一个显微镜系统购买多个设备，然后有益地组合在一起。目前主要的解决方案有： 

(1) 显微镜周围的大型环境箱。缺点是温度测量距离样品很远，温度变化可能非常缓慢。显微镜需要几个小时才能达到热平衡，缓慢的平衡也意味着与温度相关的样品漂移更显著。

(2) 平台顶部孵化器/加热平台插入物与客观加热器相结合。当使用浸油物镜时，这是一种有效但相当复杂且昂贵的解决方案。

(3) 基于 Peltier 元件的设备，具有无与伦比的温度范围，速度快且精确，但难以小型化，并且始终需要连接到元件上的散热片，例如更大的金属块，这可能是不切实际的。

(4) 基于液体流动的设备。用途广泛且运行速度快，但不是很人性化。

(5) 另一种选择是自己构建温度控制器。主要适用于商业，因为其成本高且不具有普适性。

 

三►

 

使用 VAHEAT 精确控制温度

“VAHEAT”温度控制系统操作简单，且不必担心校准或降低图像质量的问题，更重要的是可精确控制视场中的实际样品温度，并适用于单分子和超分辨率研究等高灵敏度显微镜应用设备。该装置由四部分组成，分别是：(1)智能基底(2)显微镜适配器(3)探测头(4)控制单元。核心部件是智能基底，这是一个可交换的部件，包含一个精确的四点温度探头和一个透明的薄膜加热元件。使用 VAHEAT，温度可以高达每秒 100°C 的速率变化，稳定误差在远低于 0.1°C 的设定值，且无需对显微镜进行任何修改。VAHEAT 的核心是智能基板，功能化显微镜玻璃盖玻片，其中灵敏的温度探头和透明加热元件连接成一个有源反馈回路。Smart Substrates 每秒读取和调节样品温度 83 次，确保它在不受环境条件影响的情况下精确地保持在设定值。Smart Substrates 还提供带液体样品容器的版本。该设备允许对类似于 PCR 循环仪的任意温度曲线进行编程，并且与微流体兼容。虽然主要用于倒置配置中的高 NA 物镜，除此之外，VAHEAT 系统的模块化允许将其安装在绝大多数光学显微镜上。

 

我们选择了由氧化铟锡 (ITO) 制成的透明薄膜元件和直接内置在单个芯片中的温度探头的加热策略，盖玻片，样品安装在其上，这种基于 ITO 层的加热解决方案最有利于热均匀性。

 

VAHEAT 组件。该设备由智能基板 (1) 智能基底 (2)显微镜适配器 (3) 探测头 (4)控制单元。b) 智能基板是功能化盖玻片，带有透明的纳米加热元件和直接在视野中的温度探头。c) 当 VAHEAT 设置为 60°C 时，智能基板的热图像显示整个区域均匀加热。

 

智能基板，VAHEAT 中使用的透明加热元件（基底可定制）

 

由于 VAHEAT 仅加热少量样品，因此它可以在高温下与高 NA 浸油物镜一起使用。在一项实验中，我们使用尼康 TIRF 100x/1.49 NA 物镜在 75.0°C 下运行 VAHEAT 六小时，物镜在前三个小时内由5°C 升温至 29°C 并达到平衡，这表明 VAHEAT 可在更高的实验温度下使用。同时，VAHEAT 可以帮助所有生命科学家进行温度敏感实验，对于某些领域，例如嗜热微生物的实时成像、热响应聚合物的表征或 DNA 纳米技术，它是一项突破性技术，可以实现以前无法实现的实验。自 2020 年推出以来，已开始使用我们的设备的 50 个实验室和公司在各个领域开展工作，例如单分子生物物理学、胶体化学和细胞生物学。他们使用 VAHEAT 研究相变、液晶、脂质层和囊泡以及人工细胞、极端微生物、热休克反应或溶液中的 DNA 和蛋白质。引用我们设备的第一批出版物现已发布。VAHEAT 被 Guillaume Baffou 教授（菲涅尔研究所）的实验室用于嗜热细菌的活细胞成像，以研究限制对细菌生长的影响1。在 Wolfgang Zachariae 博士（生物化学领域的 MPI）的团队中，在一个关于驱动减数分裂的机制的研究项目中，VAHEAT 被用于通过共聚焦显微镜对酵母中的温度敏感等位基因进行热休克和活细胞成像2。VAHEAT 还被用于在 Henrik Dietz 教授（慕尼黑工业大学）的实验室中使用 DNA 折纸创建人工大分子传输的研究。该研究使用单分子 TIRF 成像进行检测3。

使用即插即用的 VAHEAT 系统，从实验中导出温度记录也非常简单。因此，我们希望该设备不仅能够实现新型实验，而且有助于改进成像实验的报告和可重复性，从而为每个人提供高灵敏度显微镜。

 

关于Interherence：

德国Interherence公司拥有量子和生物光子学领域的专家团队，为高灵敏度光学显微镜的发展做出很大贡献。该团队采用了现代纳米制造和薄膜技术，推出了VAHEAT生物显微温度控制器，作为传统显微镜的附加产品，首次实现了在扩展温度范围内的精确温度控制，以确保生物物理光学研究可靠的测量条件。

上海昊量光电作为德国Interherence公司在中国的代理商，可为您提供专业的技术服务，若您对Interherence公司提供的VAHEAT生物显微温度控制器有兴趣，欢迎通过邮箱、电话或微信进行沟通！

 

关于昊量光电：

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