生物医学超分辨显微成像技术领域取得突破性进展

近日，哈尔滨工业大学仪器学院青年教授李浩宇团队在生物医学超分辨显微成像技术领域取得突破性进展。针对目前超分辨显微镜所面临的成像通量限制，团队提出基于计算光学成像的新一代高通量三维动态超分辨率成像方法，通过计算成像技术增强荧光涨落探测灵敏度，使探测灵敏度提升两个数量级以上，突破了现有显微成像技术在高通量视场、高空间分辨率和高时间分辨率等难以兼顾的难题，将目前世界上超分辨显微镜中最高通量视场成像范围提升至毫米级，可在10分钟内对包含超过2000个细胞的视场上实现了128纳米的超高空间分辨率成像，为细胞学异质性和生物医学等研究提供新的科学影像仪器。  

  6月15日，该研究成果以《通过增强荧光涨落检测实现高通量超分辨率成像》（Enhanced detection of fluorescence fluctuations for high-throughput super-resolution imaging）为题，以长文形式在线发表于国际权威杂志《自然光子学》（Nature Photonics，2021年影响因子39.7，光学类最高），这是哈工大首次在该刊物上以第一通讯单位发表论文。

超分辨成像技术的出现标志着成像领域对于光学衍射极限的突破，也极大地推动了生物医学领域的发展。利用超分辨技术，生物学家得以对病态细胞内的亚细胞结构进行精准的量化统计和直观的可视化分析。然而，常见的超分辨技术往往需要复杂的图像采集设备和特定的成像控制，并且时间分辨率低，成像通量不足，这限制了超分辨成像在生物医学中的广泛应用。

基于荧光涨落物理特性的超分辨成像技术（Super-resolution optical fluctuation imaging，SOFI）是一种经典的基于统计学的超分辨方法，可以在不借助额外光学元件的条件下突破衍射极限。但传统的SOFI技术往往需要1000帧以上的原始图像用于重建，自2009年提出至今仍然难以满足生物医学中对于大视场和细胞器瞬时动态等研究的高通量成像需求。

为了解决上述问题，李浩宇团队提出了自相关两步解卷积超分辨成像（Super resolution imaging based on Auto Correlation with two-step Deconvolution，SACD）。不同于传统SOFI需要统计大量的原始图像，SACD通过增强图像中的可探测荧光涨落特性，在每一帧图像中提取更多有效信息以实现超分辨成像。SACD在计算超分辨统计量前对原始图像进行预解卷积，这一独特的处理增强了荧光信号的开关对比度，更高效地利用信息，从而缩减了重建所需的原始图像数量。随后再将解卷积作为后处理步骤，进一步提升空间分辨率。最终，SACD可以将重建所需原始图像数量缩减两个数量级以上，并使空间分辨率提升超过两倍多，满足了生物医学研究的高通量成像需求。

高通量成像——大视场细胞骨架微管成像

研究团队将SACD方法应用于转盘共焦（Spinning Disk Confocal，SDC）系统，实现了对毫米级（2毫米×1.4毫米）视场内微管的高通量超分辨成像，包含多达2000个细胞。传统SOFI需要几乎半天的连续采样才能对整块区域完成重建，而SACD只需10分钟便可达到更加优越的成像性能。在任意区域中，SACD都保持了极高的分辨率，能够清晰地分辨邻近的微管结构，解析出转盘共焦显微系统无法得到的高频信息。

活细胞长时程成像——活细胞线粒体外膜动态成像

为了克服低信噪比与长时程的活细胞成像条件，李浩宇团队在SACD的基础上引入了之前开发的稀疏解卷积技术（该团队于去年发表在《自然生物技术》期刊上，Weisong Zhao et al.，Nature Biotechnology，40，606–617，2022）。Sparse-SACD使快速而复杂的细胞器动态过程得以可视化，实现在超过10分钟的时间内对COS-7活细胞线粒体进行快速动态成像。得益于该技术的高通量与稳定性，线粒体被解析为中空的膜状细胞器，整个细胞中线粒体的裂变和融合过程都被清晰地记录下来。

图为活体四维超分辨成像。转盘共焦显微镜（SD-confocal，左）和Sparse-SACD（右）在37°C下对Skylan-S-TOM20标记的活COS-7细胞进行四维成像。比例尺：5微米。 最后，研究者使用SACD技术进行了全活细胞四维超分辨成像，即在超过10分钟时间（成像温度37°C）内对COS-7活细胞的线粒体外膜网络进行三维超分辨体成像（上图）。与传统共焦系统相比，精细结构的可见性得到了根本性提高，线粒体被清晰地成像为锐利的中空膜结构。通过稀疏性和连续性的双重约束，SACD高保真地实现了随时间变化的全细胞线粒体裂变与融合成像。

形象地说，分布在荧光背景中的单个分子波动信号就像“迷雾中闪烁的星星”，SACD在计算统计量之前尽可能地消除了这种“迷雾”，以便在真实的生理环境下实现高质量的超分辨成像。通过充分利用原始图像中的荧光涨落信息，SACD打破了现有超分辨技术的通量限制以及需要特殊光学控制的设备限制，同时还能够直接应用于现有商业化共焦荧光显微镜系统（或其他任何荧光系统）中，有助于低成本、高通量地进行相关生物医学研究，有望成为生物学家分析细胞结构和瞬态动力学的常规仪器。

值得一提的是，SOFI技术的发明者、德国乔治-奥古斯都-哥廷根大学教授安德雷恩（J.Enderlein）是该工作的审稿人之一。安德雷恩教授表示：“在涨落分析之前进行预解卷积的想法很新颖，非常合理，因为这应该是消除虚假涨落的好方法”“使用这种技术呈现的图像质量非常好”“我认为所提出的方法会是更优的”。

  哈工大李浩宇教授和北京大学陈良怡教授为论文的通讯作者；哈工大助理教授赵唯淞为论文的第一作者，论文共同第一作者还包括北京大学赵士群副研究员、哈工大博士研究生韩镇谦和丁相妍，论文的共同通讯作者还包括哈工大丁旭旻教授和北京大学郭长亮副研究员。哈工大谭久彬院士为论文共同作者和哈工大科研团队负责人。该项研究成果主要由哈工大仪器学院和北京大学未来技术学院合作完成，哈工大为论文第一通讯单位。

编辑：黄飞