微重力下3D组织结构的生物制造及其在人体病理生理研究中的应用

近年来，人们对生物工程的兴趣日益浓厚，尤其是体内类3D功能组织，这促进了生物制造过程新方法的建立，并扩大了这些独特的组织结构的应用。太空飞行过程中产生的微重力是一种独特的环境，可能有利于组织工程过程，但不能在地球上完全复制。此外，在太空中进行人类和动物研究的费用和实际挑战使生物工程微生理系统成为一种有吸引力的研究模式。

基于此，近期，约翰·霍普金斯大学的Deok-Ho Kim教授和美国布朗大学的Peter H.U. Lee教授对相关研究，例如利用真实和模拟的微重力来改善各种组织类型的生物制造，以及使用微生理系统（如器官/组织芯片和多细胞类器官）在空间中建立人类疾病模型等进行了总结，并讨论了真实和模拟的微重力平台及其在组织工程微生理系统中的应用，包括：（1）应用微重力条件改进组织结构的生物制造；（2）利用在微重力条件下制作的组织结构作为地球上人类疾病的模型；（3）利用生物制造的体外模型研究微重力对人体组织的影响。相关内容以“Biomanufacturing of 3D tissue constructs in microgravity and their applications in human pathophysiological studies”为题发表在Advanced Healthcare Materials期刊上。

真实微重力（r-μG）可以通过在飞机或太空飞行器上的自由落体飞行模式来实现。根据飞行的高度，这些平台可以分为抛物线、亚轨道和轨道（图1）。飞机上的抛物飞行通常在大约10公里的高度进行（图1A）。在抛物线飞行期间，一架飞机在大约20 ~ 40秒的自由落体r-μG阶段和1.8 G的超重力上拉阶段之间交替飞行20 ~ 60条抛物线（图1B）。与抛物线飞行不同，亚轨道飞行（图1C）有一个更长的轨道，可以达到海平面以上100公里，达到空间的技术边界。国际空间站（ISS，图1D、E）于1998年发射后，作为μG研究环境实验室，是目前使用最密集的r-μG研究平台。

图1 用于生物研究的真实微重力平台

旋转壁容器（RWV），或旋转细胞培养系统（RCCS）由一个可以装满培养基的圆柱体组成，并以恒定的速度围绕其中心轴不断旋转，以及一个氧气补充单元，或者在培养柱的中心作为一个较小的静态钢瓶，或者在其底部作为一个多孔板（图2A）。

RWV通过向上的水动力牵引，迫使圆柱体中的粒子进行连续的圆周运动，从而创造了μG条件，这反过来在理论上与旋转过程中产生的向下重力相抵消（图2B）。恒定器是一种装置，它使样品围绕单个或多个轴连续旋转，以抵消向下的重力对生物系统的影响（图2C）。

在旋转过程中，样品向下的重力可以在数学上平均为零，在旋转轴周围产生一个类似μG的理论环境（图2D）。与2D倾斜器使样品保持在圆柱形表面上旋转不同，3D倾斜器使样品在虚拟球形平面上旋转（图2E）。为了获得更好的μG模拟结果，研究人员通过随机化两个轴的转速和方向，进一步优化了3D倾斜器（图2F）。

图2 工程组织模拟微重力的方法

生物制造的目标是生成与生理相关的功能性3D组织结构，如微组织（即球状体）和具有典型的细胞和大分子组织的类器官。3D细胞结构允许相同或不同类型的细胞之间的多维附着和相互作用，与2D细胞培养相比，这更好地模拟了体内环境。因此，3D组织结构被更多地用于临床应用，包括体外疾病建模和植入。在模拟微重力（s-μG）环境中，细胞可以悬浮在培养基中，形成具有改进的生理特性的多细胞球状体，包括更大的尺寸、更小的缺氧中心、微结构，以及有或没有微载体作为支架的组织特异性标记物的表达（图3）。例如，RWV（图3A左）制作的人骨类器官比标准重力（图3A右）表现出更高的碱性磷酸酶（ALP）的表达。

在RWV中形成的人胚胎干细胞来源的神经类器官显示了神经标记物MAP2的表达（图3B）。在RWV中形成的人肝类器官具有多层结构（图3C）。在r-μG条件下形成的人诱导多能干细胞（hiPSC）来源的心脏类器官比在标准重力条件下形成的球状体显示出更大的直径（图3D）。在RWV中培养的类器官中可以观察到滋养层细胞的融合（图3E）。在RWV中形成的人肠上皮类器官显示了上皮特异性抗原（ESA）的表达（图3F）。

图3 在模拟和真实的微重力环境中制备的组织类器官

如上所述，在μG环境中形成的特定组织类型的3D多细胞球状体表现出包括仿生性、复杂的微观结构和更小的缺氧面积等生理特性。因此，它们是体外疾病建模和细菌感染及细胞-细胞相互作用研究的理想选择（图4）。此外，μG诱导的心脏功能障碍、骨丢失和骨骼肌萎缩已经在μG平台上使用体外组织模型进行了研究。相关研究利用在μG平台上制作的组织模型，研究了甲状腺、肺和肠等器官的非微重力相关病理。

图4 利用微重力平台作为工具研究人体的病理状况

目前，已有研究人员利用A549肺上皮细胞与微珠共培养的类器官在旋转壁血管（RWV）中形成了结实的3D聚集（图5A）。感染表达GFP的铜绿假单胞菌后，球状体显示绿色感染区域（图5B）。HCT-8细胞系的类器官在RWV中培养后显示出柱状上皮样结构，并表现出细小隐孢子虫局部感染（黑色箭头）（图5C、D）。在RWV中制备的肝肿瘤类器官显示在2周时HCT-116结肠癌细胞（红色）的增殖（图5E）。在用激动剂BIO或拮抗剂XAV939调节WNT通路后，HCT-116细胞的增殖发生了明显的变化，说明WNT通路影响HCT-116的增殖（图5F）。

图5 在s-μG环境中制备的组织类器官的代表性病理研究应用

此外，更多组织类型的微生理系统正在被应用于许多正在进行的空间生物学项目中（图6）。这些被资助的项目包括不同组织类型的应用，如hiPSC衍生的工程心脏组织、肾脏近端和远端小管组织芯片、人类骨骼肌模型和人类血脑屏障芯片等。

图6 已在ISS美国国家实验室飞行的代表性组织芯片  

综上所述，该论文总结了微重力用于有、无支架的各种细胞类型的3D构建。除了可以产生模拟微重力和不同支架类型的生物反应器外，这些细胞系本身也可以被认为是选择其特定生成潜力的工具。干细胞由于其多能性，通常最有利于3D结构的形成。通过在微重力模拟平台上共培养多种细胞类型，也可以形成更大的仿生结构，为个性化医学和病理研究提供更精确的模型。虽然微重力已被证明可以增强类器官的形成，但抑制球状体形成的矛盾结果也存在。这可能归因于使用了不同的方案，包括支架的大小和培养时间。然而，某些组织类型的发展，特别是肌肉组织，可能会因微重力改变的机械感应途径而变得复杂，这使得这些平台可能在研究这种病理机制方面更加有用。总的来说，空间医学生物学的研究加强了对推进再生医学领域的努力。随着人类继续冒险进入“最终前沿”，研究人员也必须继续探索生物医学科学和生物工程的新前沿。

审核编辑：刘清