用于高效体外mRNA转录的具有微纤维通道的微流控生物反应器

理想的微流控生物反应器（MBR）应具有高混合效率（ME）、快速混合、易于制造、低成本以及与反应物和产物的低相互作用等关键特征。为了解决这些问题，来自韩国天主教大学的Sung-Wook Choi开发了一种新型全氟聚醚（PFPE）-MBR，使用一种简便且经济有效的方法进行连续体外mRNA转录（图1a）。具有两个混合单元和长大通道的MBR促进引入成分的完全流体混合，从而实现高产率的mRNA合成。同时，研究人员表明该微流控体外转录是使用微流控混合系统连续mRNA合成的首次演示。相关论文以“Microfluidic Bioreactor with Fibrous Micromixers for In Vitro mRNA Transcription”为题于近期发表在Nano Letters期刊上。

图1 PDMS微混合器的制造过程示意图

图1a显示了将3个聚二甲基硅氧烷（PDMS）层组装成微流控装置。具有入口/出口端口的顶层具有使用3D打印图案作为模板制备的半圆形大通道（图1b），中间层有一个由三个混合单元组成的微混合器。使用电纺微纤维盘作为模板制备具有纤维微通道的混合单元，从两个入口引入的流体在顶层的大通道中相互接触。随后，液流经过反复的混合单元和大通道，最终流出至出口。此外，大多数纤维微通道呈现出随机弯曲的结构，从而产生旋流。此外，在微通道处可以清楚地观察到许多连接纤维微通道的连接点（图1c）。

为了评估混合性能，研究人员将含有绿色荧光染料的水溶液和不含荧光染料的水溶液通过每个入口分别引入微混合器，两股入口流在Y形大通道处合并成一股流，然后引入第一混合单元。在不同流速下在微混合器的入口和每个窗口捕获荧光显微镜图像。为了进行比较，使用没有微纤维通道的微流控混合器作为对照。图2a显示了对照和不同MBR的每个窗口的代表性荧光显微镜图像和相应的横截面强度分布。与对照不同，随着所有类型的微混合器中三个混合单元的通过，荧光强度趋于变成半圆形，表明接近完全混合。微纤维通道直径较大的微混合器表现出更好的混合性能。

图2 微型混合器的混合效率及其特点

接着，研究人员准备了一个具有薄中间层（厚度约为34 μm）的微混合器，通过避免明亮的荧光背景，使用荧光显微镜监测流动行为。图3a显示了薄型微混合器中含有绿色荧光染料的水相的延时荧光图像。从大通道引入的水相在微混合器中沿着纤维微通道分成许多子流。子流在整个微混合器的连接处反复分裂和交叉（图3b ~ 3c）。微纤维通道的弯曲结构可以诱导旋流，从而增强ME。除了多重分流/交叉机制外，纤维微通道由于其混沌和随机的结构，促进了混合流在微混合器中的循环利用，从而提高了ME。综上所述，优异的混合性能可归因于混沌纤维微通道的独特几何形状和多个连接处。

图3 微纤维通道的延时荧光显微镜图像

微流控生物反应器（MBR）由两个带有纤维微通道（混合部分）和一个长宏观通道（反应部分）的混合单元组成用来演示连续的mRNA IVT。有两个入口用于引入由IVT成分组成的溶液1和溶液2。溶液1是T7 pol、rNTP和转录缓冲液的混合物，而溶液2是模板DNA、增强子和转录缓冲液的混合物（图4a）。如图4b所示，模板DNA和mRNA在PDMS基底上的吸附量分别为8.54% ± 1.95%和8.81% ± 1.20%。相比之下，PFPE基底上吸收了极少量的模板DNA（0.63% ± 0.42%）和mRNA（0.15% ± 0.11%）。吸附量的差异是由于PDMS的固有疏水性和PFPE材料的低表面能造成的。因此，选择PFPE作为mRNA IVT的MBR材料。
 

接着，以0.4 mL/h的总流速，每20 min在出口收集合成产物，然后计算mRNA合成效率。将合成的mRNA量与批量IVT中的合成量进行比较。mRNA合成效率随着时间的推移而增加，然后达到接近100%的平台（图4d），表明与批量IVT没有显着差异。由于反应物溶液的量极少，很难将两种溶液同时引入MBR。初始阶段的低合成效率归因于溶液1和2之间的不平衡。如图4c所示，较高的流速导致较低的ME值。因此，以总流速的0.4 mL/h和1.6 mL/h评估流速对mRNA合成效率的影响（图4e）。MBR中的mRNA合成效率接近100%，而对照装置中的mRNA合成效率仅限于74%。这些结果表明，快速混合在相同反应时间内的mRNA合成效率中起着重要作用。

图4 PFPE-MBR中的连续体外转录特性

为了确认完整性，使用Agilent 5200片段分析系统对本体和MBR中合成的mRNA进行了分析。本体和MBR中合成的mRNA的电泳图像和电泳图显示，两mRNA均由1804个核苷酸（nt）组成，表明大小相同（图5a）。为了验证mRNA的性能，在完全培养基中用与Lipofectamine复合的mRNA转染Nor10细胞（图5b）。等量mRNA的转染在转染后6小时和24小时产生了相当的荧光素酶表达水平。这些体外实验表明，在MBR中合成的mRNA表现出与批量合成的mRNA相当的性能。对于体内荧光素酶表达测定，将大量合成的荧光素酶mRNA和MBR注射到小鼠耳部皮肤中。与体外转染结果相似，两种mRNA的表达水平没有显着差异（图5c）。这些结果证实，MBR中合成的mRNA与明确的批量IVT中合成的mRNA具有相同的特性和功效。

图5 mRNA的完整性测试和性能评估

综上，该研究提出了使用电纺纤维基质作为模板的具有微纤维通道的微流控混合器的简便制造方法。均匀混合主要取决于引入的流体在整个微混合器的许多连接处的混沌分裂和交叉。即使混合长度较短（4 mm），微混合器16在各种流速下也表现出接近0.9的高ME值。小型微混合器中存在大量连接点是该微混合器设计的一个关键特征。三个混合单元的通过导致均匀的流体混合，ME值大于0.95。这种方法的主要特点如下：（1）微混合器制造过程简便；（2）不需要外部能量；（3）在短时间内和长度内具有高ME值。此外，使用PFPE-MBR和微混合器证明了mRNA的连续生产具有高产量。PFPE-MBR具有优异的混合性能以及对反应物和产物的惰性，可以成为各种化学和生物反应的平台。

审核编辑：刘清