开发一种计算机视觉方法来自动识别芯片上的阳性和阴性样本

微流体的运输、分配和混合通常需要借助额外的器件，如泵和阀门，不利于其在即时诊断（POC）装置中的应用。因此，美国加州大学Du Ke教授及其团队提出了一种简单的微流控病原体检测系统，称为旋转芯片，通过手动旋转两个同心层在微孔之间转移试剂，而不使用外部仪器。该旋转芯片是由一个简单的计算机数控（CNC）加工工艺制造的，并能够通过一个简单的30度或60度旋转进行60次多路反应。利用超疏水涂层，在没有明显泄漏的情况下，流体输送效率可以达到92.78%。与细胞内荧光检测相结合，对耐淀粉类大肠杆菌（E. coli）的芯片上检测限为1.8×10⁶ CFU/mL，这与该研究的芯片外检测结果相似。此外，该研究还开发了一种计算机视觉方法来自动识别芯片上的阳性和阴性样本，显示了100%的准确性。

该旋转芯片具有简单、低成本和高通量的优势，并可以用单个芯片图像显示测试结果，是在资源有限的环境下进行各种多路复用POC应用的理想选择。相关研究内容以“Superhydrophobic Rotation-Chip for Computer-Vision Identification of Drug-Resistant Bacteria”为题发表在ACS AMI期刊上。

图1a显示了大肠杆菌检测试验的结果，在透照器的紫外光下，在旋转芯片中可以观察到定性检测结果。图1b显示了旋转芯片作为一对数控加工的具有不同特征的聚碳酸酯圆盘的组装。图1c及其附属横截面图显示了在试验中运行测试组的操作机制，其中蓝色和红色液体分别代表试剂和样品。在图1d中，两步芯片执行相同的流体动力学，但加入二次试剂产生两种试剂的混合物，在60度旋转结束时混合样品，分别用红色、紫色和黄色表示。

图1 旋转芯片的设计和操作

图2a分别为无涂层的旋转芯片、特氟隆涂层和neverwet涂层的接触角（从左到右），其中，NeverWet涂层处理的疏水性最强，其静态接触角为156.8°。旋转芯片在NeverWet涂层前后的扫描电镜图像如图2b所示，NeverWet涂层由氟碳涂层的二氧化硅颗粒组成，以产生表面粗糙度和天然的超疏水性。NeverWet涂层旋转芯片在不同条件下的泄漏计数如图2c所示。图2d显示了未涂层、聚四氟乙烯涂层和NeverWet涂层旋转芯片的传输效率结果，NeverWet涂层芯片运输92.78%，而特氟隆涂层的试剂仅为86.02%。图2e是在NeverWet涂层前后的两步芯片上的食品染料演示，在NeverWet涂层（上排）之前，在试剂加载和芯片旋转过程中都有液体泄漏，经过NeverWet涂层（下排）后，液体泄漏显著最小化，避免了样品污染，提高了试剂利用率，提供了更准确的结果读数。

图2 旋转芯片的表面处理及传输效率

图3a显示了β-gal对非荧光FDG的两步连续水解，首先将其转化为单-半乳糖苷酶（FMG），然后转化为高荧光荧光素（激发/发射，488/512），可以通过LED透照器检测到。对纯化的不同活性（0 - 1 U）的β-gal进行反应的芯片外检测结果的荧光强度（512 nm）如图3b所示。随着β-gal浓度的增加，FDG水解产生更多的荧光素，荧光强度增加（图3c）。在上片实验中，在试剂阵列中加入100 µL FDG，每孔中依次加入5 µL β-gal。经过旋转和孵育后，用LED照明器从底部激发芯片，结果如图3d所示。

图3 β-半乳糖苷酶（β-gal）对荧光素二ß-D-半乳糖糖苷（FDG）的影响

如图4a所示，当大肠杆菌浓度高于1.8 × 10⁶ CFU/mL时，用肉眼可以很容易地观察到阳性组和阴性组之间的荧光差异。然后用荧光光谱仪定量各组的荧光强度，在FDG浓度为0.25 nM时的结果如图4b所示。当FDG浓度为0.25 nM时，四组间的积分荧光信号最高，log-log线性拟合最佳（Pearson‘s r = 0.9734）（图4c），因此选择了0.25 nM的FDG进行上片实验。孵育前的FDG和大肠杆菌负载芯片，大肠杆菌浓度在1.8 × 10⁶ ~ 9 × 10⁷ CFU/mL之间（图4d（上））。当大肠杆菌浓度高于1.8 × 10⁶ CFU/mL时，很容易观察到荧光信号，与芯片外的结果相当（图4d（底部））。

图4 通过改变FDG浓度优化大肠杆菌

图像处理和测试样本分类的整个管道如图5所示。将检测到的阳性样本与阴性样本分离，最终获得了100%的分类准确率。

图5 计算机视觉的图像处理和测试结果

综上所述，旋转芯片与其他POC系统相比，由于其设计、操作和可制造性，在病原体检测方面有许多优势。首先，旋转芯片的设计具有良好的便携性、高通量和可靠性。通过采用旋转设计，旋转芯片可以提供相同的流体操作，同时保持所有敏感特性在一个覆盖状态，并保持机械完整。这种设计降低了芯片的空间足迹，并增加了其最大特征密度，以提高可移植性和通量。疏水性表面处理是一种有效的防泄漏解决方案，而不影响机械完整性或需要专用密封，可以通过使用市面上廉价且易于应用的的喷涂涂层来实现超疏水表面。其次，旋转芯片的简单设计只需要一个简单的手动操作，以及一个简单的四步过程：加载、旋转、孵育和读取。用户可以遵循上述流程，在无需使用复杂实验室设备或解释荧光曲线的情况下获得定性结果。这降低了过程的复杂性，并进一步降低了成本，无需使用水浴及其附件供应，如可密封袋，以防止水在孵化期间进入芯片。在未来，智能手机应用程序可以开发使用本研究中强大的计算机视觉的方法，并直接与旋转芯片结合，以精确、自动和高通量的检测应用程序。

审核编辑：刘清