一文详解TIRF和SPR成像系统的环形照明

众所周知，入射角的正弦值与折射角的正弦值满足如下关系：n1sin（i）=n2sin(r) ，假设n1=1.52（玻璃），n2=1（空气），当折射角度等于90度时，对应的入射角度是临界角：i=arcsin(1/1.52)，临界角大概在41度左右。当入射角大于或等于临界角的情况下，此时折射光线消失，即发生了全反射，

有人总结了全反射的九大应用：

1、光导纤维；2、全内反射荧光显微镜；3、全内反射是汽车雨量传感器的工作原理，控制挡风玻璃雨刮器；4、光的空间滤波；5、双筒望远镜中的棱镜使用全内反射显示直立图像；6、一些多点触摸屏幕使用全内反射拾取多个目标；7、前房角镜检查采用全内反射来观察眼睛角膜和虹膜之间形成的解剖角度；8、步态分析仪器使用受抑全内反射分析啮齿动物的足迹；9、光学指纹设备使用受抑全内反射记录人的指纹图像。

全内反射荧光显微镜（total internal reflection fluorescent microscope，TIRFM），利用光线全反射后在介质另一面产生衰逝波的特性，激发荧光分子以观察荧光标定样品的极薄区域，观测的动态范围通常在200nm以下。因为激发光呈指数衰减的特性，只有极靠近全反射面的样本区域会产生荧光反射，大大降低了背景光噪声干扰观测标的，故此项技术广泛应用于细胞表面物质的动态观察。

TIRFM的实现是通过改变激光的入射角来实现的，按技术TIRF显微镜分为两种：棱镜型和物镜型。棱镜型TIRF显微镜采用棱镜产生衰逝波，并用物镜收集荧光成像。物镜型TIRF显微镜采用大数值孔径物镜产生衰逝波，同时采用物镜收集荧光成像。与棱镜型TIRF显微镜相比，物镜型TIRF的应用更为广泛，它的基本结构见图2：

图2 全内反射成像的基本原理（荧光没有特意标出）

入射光线通过物镜中心的一边以大于全反射的角度汇聚到样品一点，然后经过物镜的另外一侧传播（如果是荧光样品，出射的光线波长不一样）。通常要求从全内反射显微物镜出射的激发光能够以观察区域为中心绕系统光轴旋转,从而实现全角度的全反射照明,常规的作法是使用一个二维振镜组配合一个大口径透镜将入射激发光聚焦在全内反射显微镜物的后焦面上并使其绕光轴环状扫描,进而达到全角度的全反射照明的目的。这个方案对于二维振镜组的控制电路要求极高,不仅要求其具有很高的同频和响应速度，因此,全内反射荧光显微镜中扫描模块设计复杂，很难实现到实际仪器系统中。

解决的方案之一是使用环形锥透镜实现环形照明，如图3所示：

图3 圆锥透镜的工作原理

使用圆锥透镜是可以产生环形照明，而且环的尺寸在不同位置尺寸可以改变。但是这种结构也是很难使用到TIR显微镜系统，因为很难得到平行光的环形照明，其次当改变环形的尺寸的时候，位置要发生变化，即系统的参数发生变化，很难实际使用。因此国内外的科学工作者做了很多努力解决这个问题（如使用SLM或者DMD）。例如，浙江大学刘旭团队授权的发明专利“基于数字微镜元件的全反射显微镜环形扫描方法和装置”，如图4所示：

图4 基于数字微镜元件的全反射显微镜环形扫描方法和装置

使用数字微镜是一个不错的实现环形照明的方案，但也是有一定的局限性，DMD的价格昂贵到不是主要问题，主要是由于衍射和光源能量损失比较大。西安交通大学雷铭教授在德国工作期间，2010年与Andreas Zumbusch在Optical Letters发表了采用W-锥镜实现了环形照明，图5：

图5 使用W-锥镜的全反射环形照明

W-锥镜的全反射环形照明是非常聪明的一个方案，重要的是在平行光路中工作，非常容易改变环形照明的尺寸。视频1可以看到改变环尺寸的过程：

视频1 W-锥镜的工作示意图

这个技术是来源于1986年美国的一项专利技术，如图6所示：

图6 W-锥镜的环形照明的专利信息

雷铭教授在图5发表的文章中，非常尊重历史的引述了专利信息作为参考文献，8. G. T. Sincerbox, H. W. Werlich, and B. H. Yung, “Brightfield/darkfield microscope illuminator,” U.S. patent 4,585,315(April 29, 1986)。

这里还有一个小小的插曲，雷铭教授曾经谈起他使用W-锥镜的经历，在没有读到美国这个专利的情况下，一天和同事讨论出W-锥镜的方案，两个人非常的高兴准备申请专利，没有想到检索发现Sincebox已经在86年申请了专利。

W-锥镜的方案在1986年就提出来了，没有引起多数科学工作者的注意和使用，原因是作为非球面的内、外锥加工精度要求还是比较高，2012年笔者也是试图使用这个环形照明方案用在SPR显微镜中，遗憾的是很难找到合适的加工商没有实现。

随着光学加工的水平不断的提高，平行光的环形照明使用在TIRF和SPR显微镜中终会实现。

PS：  

SPR和TIR成像系统结构非常的类似，也是有环形照明的需求。一般情况下SPR共振角度比全反射角度要大一些。因此在推送内容的主体部分没有特意提及SPR成像系统。另外文中关于TIR和TIRF也是没有特意的区分，因为系统结构基本一样，主要区别是荧光系统需要使用二相色镜、激发和发射滤光片而已。这里作为附录简单介绍一下SPRI：亚利桑那州立大学的研究人员首次利用表面等离子共振（SPR）效应开发了一款等离子激元散射显微镜（PSM），并成功实现了对单个分子（本研究中为蛋白质）的成像。目前，该工作于2020年9月21日以题目为“Plasmonic scattering imaging of single proteins and binding kinetics”发表在Nature Methods上。其中使用的仪器系统就是SPR显微镜，如图8右所示：

图7 TIR和SPR成像系统的对比

从图7的对比可以清楚看到两种系统都是使用环形照明。






 审核编辑：刘清