一种大视场结构照明显微镜设计

导读

结构照明显微镜（SIM）具有成像速度快、侵入性小、分辨率超高、具有光学切片成像能力等优点，在生物学研究中得到了广泛的应用。然而，使用空间光调制器（SLM）进行条纹投影的传统SIM通常具有有限的成像视野。

主要内容

本文报告了一种大视场SIM技术，该技术结合了用于条纹图案投影的2D光栅和用于选择条纹方向和数字相移的SLM。该方法基于UPOLabs的HDSLM80R空间光调制器搭建的安装图如下图所示。

大视场SIM的示意图

该SIM技术打破了数字投影器件限制条纹数的瓶颈，同时保持了传统SIM高速（数字）相移的优势，避免了SLM的像素化和色散效应，该技术可广泛应用于生物学、化学和工业领域。

光学显微镜是许多领域不可或缺的成像工具。然而，光学显微镜的空间分辨率受衍射限制在λ/2，一般为200nm。在过去的三十年中，超分辨率（SR）显微镜方法，包括定位显微镜（PALM/STORM）、受激发射耗尽显微镜（STED）和结构照明显微镜（SIM），以将空间分辨率提高到数十或几纳米。在SR技术中，SIM因其高速和最小的侵入性而脱颖而出，因此最适合对活体样本进行成像。SIM通过记录用周期性图案照亮样品而产生的摩尔纹图案来提供SR图像，从而将通常无法检测到的样品高频降频到系统带宽中。

使用 SLM 和针孔的 SI 条纹方向选择滤波。在将二元光栅加载到SLM之前和（b）之后对±1st光谱（a）进行针孔滤波。将二进制光栅加载到 SLM 之前和之后的光谱 （c）。分别在将二元光栅加载到SLM之前和（f）之后产生的照明模式（e）。

如今，SIM通常使用数字微镜器件（DMD）或空间光调制器（SLM）来生成和切换不同方向的结构化照明模式并执行相移。使用这种投影设备可以实现高达每秒数十帧（FPS） 的高帧率。二维光栅的投影产生1760条条纹（是传统SIM的3倍），避免了SLM/DMD的像素化和色散效应。此外，SLM用于选择SI条纹方向并执行相移，从而显著提高了成像速度。该论文通过对荧光珠和百合柱头进行成像，实验证明了所提出的大视野SIM的特征。

图 4.在直径为 240 nm 的荧光珠上进行宽视场和 SIM 成像。（a）荧光珠的宽视场（左）和SIM图像（右）。放大了不同位置的五个感兴趣区域（ROIs），以便更好地比较宽视场和 SIM成像模式 [在面板（b）和（c）的顶部]。（b）沿穿过两个相邻珠子的线的强度分布，如（2）[见图4（b）]。（c）空间分辨率统计。

本研究提出了一种大视场SIM设备，该设备使用二维光栅和SLM来获取大视场、超分辨率成像。首先，由于光栅投影的视场大，其吞吐量是传统SIM卡的三倍。其次，所提出的配备振幅光栅的配置与多色SIM成像兼容，避免了DMD的像素化和色散效应。与现有的光栅投影SIM卡相比，该方法使用SLM进行条纹方向旋转和相移。因此，它具有卓越的成像速度。所提方法的当前帧速率受CMOS相机的限制，其帧速率为23FPS。在目前的实现中，结构化图案的方向被限制在两个正交方向上，从而影响了空间分辨率和成像速度。在所提出的方案中，可以使用可能产生更多衍射方向的达曼光栅在三个或更多方向上产生结构照明，从而实现更各向同性的分辨率增强。然而，所提出的方法也存在缺点：首先，当两个条纹方向之一下降时，照明强度会损失50%;其次，由于涉及物理光栅和SLM，该方法具有相对复杂的配置。

审核编辑：汤梓红