智能传感技术：探索生物阻抗应激的新视角

★ 欢迎引用:

Yang, H., Huang, W., Chu, S., Zhang, X., & Wang,X. (2024). In situ assessment of stress level in perch during cryogenicwaterless live transportation using multisource impedance electrodes. Sensorsand Actuators A: Physical, 115083.

★  研究背景

传统的活鱼应激水平判定基于生化指标测试方法，例如血糖，皮质醇等，面临着费时费力的困境。为此，中国农业大学王想副教授、张小栓教授团队开发了基于三种材质和四种形状的阻抗电极以及后端的阻抗测量系统，用于无水低温环境下鲈鱼的应激水平监测。试验旨在比较电极的不同材质和形状对测量结果的影响和通过测量肌肉收缩变化来准确评估鱼类的应激状态。结果表明，片状同侧，铜材质的电极是监测鲈鱼应激水平的最佳电极，通过数据挖掘和形态学特征提取方法将12h内鲈鱼的应激水平分为急性应激，体内调节，适应应激，累积应激和濒死五个阶段，该结果与标准的血糖数据相匹配。基于ANN模型的应激水平预测模型取得了高达91.66%的预测精度，证明了系统的有效性。这项研究有利于提高活鱼运输过程中的健康管理水平，为推动智慧渔业的发展迈出了一步。

★  文章解析

以鲈鱼为例，本研究探讨了使用阻抗谱法判定鲈鱼应激水平的可行性，还重点关注了不同阻抗电极对鲈鱼应激水平的预测效果，图1展示了本文的研究框架。我们提出了一种创新的方法来评估鱼类的压力水平，包括比较电极属性和通过测量肌肉收缩变化来准确评估鱼类的应激状态。根据压力水平评估结果，我们将鲈鱼分为不同的应激等级，以便针对不同等级的鱼类制定相应的调控措施。此外，压力水平评估还可以帮助监测鲈鱼在不同环境和运输条件下的应激反应。基于机器学习算法的应激水平预测模型取得了高达95.16%的预测精度，随着时间的增长，活鱼的应激水平不断增加，与实际的血糖数据相匹配。这项工作有利于准确把握活鱼运输过程中的应激状态，从而为相关人员提供决策依据。

图1：框架图

鲜活的鲈鱼从北京市圣熙八号市场直接购买，然后立即有水充氧运输至国家食品质量安全北京实验室。所有的鱼体均是健康无损伤的，经过禁食1.5天后，对鱼体进行降温处理，速率控制在3℃/h，此步的目的是诱导鲈鱼进行最佳的休眠温区。然后立即放入无水保活包装袋中，试验温度保持在4℃左右。试验分为两个批次进行。

试验1：确定最优的电极材料和电极形状。针对三种材料的五种贴附方式，取15条鲈鱼对15种电极进行寻优试验。具体体现在，针对鲈鱼从健康到濒死的过程，使用试验电极对鱼的两种状态进行阻抗谱测量。默认实验开始时鲈鱼的生命健康特征最为明显。默认鲈鱼的呼吸频率首次为0的状态为其濒死状态。记录鲈鱼从健康到濒死的持续时间。

试验2：进行最优电极的持续监测试验和生化指标测试试验。试验2分为两组，第一组根据试验1中筛选中的最优电极，选择10条鲈鱼进行长期的健康监测试验，旨在采集鲈鱼生理阻抗信号的变化规律，阻抗信号采集频率定义为10min/次。试验时间根据试验1中鲈鱼从健康到濒死的持续时间决定。第二组，每隔1h进行鲈鱼血糖浓度的采集，并观察鲈鱼的呼吸频率变化。该步骤旨在反映鲈鱼在试验过程中的真实应激水平。

图2：试验图

在选择最优电极时，分别对鲈鱼的初始状态和濒死状态进行阻抗谱测量。（默认初始状态为肌肉收缩，濒死状态为肌肉舒张）结果如图3所示。电极带的长而窄的电极表面适合于大面积鱼肉样品的测量，能够更好地与样品接触，但使用电极带测量时需环绕鱼体，操作较为繁琐。测得的数据中，模值数据相差不大，相角数据只有铜电极区分较为明显，如图3a所示。圆环电极测量位置为躯干中间较为平坦的地方，有利于增加电极与鱼体的接触面积。测得的数据中，模值数据几乎相同，铜电极和不锈钢电极的相角数据有一定的区分，如图3b所示。但实际操作中发现，该结构的电极限制了测量对象在中心区域的湿润程度，可能影响在该区域内阻抗测量结果的重复性。片状电极测量位置选择在鱼背鳍和躯干相交的位置，为防止测量时片状电极的偏移现象，将无尘布润湿后搭配片状电极紧紧贴附在鱼体表面。

片状电极有同侧排列和异侧排列两种数据收集方式，如图3c-d所示。测量的相角数据无论低频和高频都很顺滑，没有明显的毛刺，同侧电极的测量结果由于异侧电极，对鲈鱼不同的状态有着非常明显的区分。针状电极具有尖锐的几何形状，能够集中电场，提供较高的局部电场强度。如图3e所示，针状电极相比与上述结构的电极，它插入了鱼体的内部。数据整体较为顺滑，没有明显的锯齿和毛刺，数据质量较为不错，对鲈鱼不同的状态有着明显的区分。材料方面，可以明显看出不同材料在同一电极形状下趋势基本相同，所以在材料对测量结果的影响不大。

银具有最佳的电导率，但是，银电极成本较高，且易受环境影响，同时，银也对鱼体具有一定的毒性。不锈钢的电荷传递效率较低，且易发生腐蚀现象，从而影响到实验结果的准确性。相比之下，铜电极因其较高的电导率能够实现与鱼体之间更高效的电学信号传递。同时，铜相比银和不锈钢而言更加耐用，能够有效降低试验的成本。因此，选择铜电极作为后续试验的电极。综上所述，铜材料的片状电极和针状电极的效果较为优秀，选择这两种电极进行下一步研究。同时片状和针状分别为无损接触式和有损插入式，是两种不同类型的电极。

图 3：测量数据

相比于阻抗谱的模值曲线，相角曲线拥有更为丰富的图像信息，从细胞层面来分析也该是如此。图4a-c展示了鲈鱼在无水低温环境下的细胞电流路径变化。其中，具有导电特性的胞外液和胞内液可等效为电阻，具有绝缘特性的细胞膜可等效为电容。根据电路理论，被细胞膜阻断的低频电流只能通过细胞外液（图4a）。但高频电流能够穿过细胞膜同时经过细胞外液和与细胞内液（图4b）。细胞膜上存在多种离子通道，当这些通道受到适当的刺激或调节时，离子通道会开放，允许特定离子通过。这些离子的运动也会形成电流（图4c）。电流流经路径的不同在模值曲线上只能反应为数值大小的变化，但在相角曲线上，由于呈容性的细胞膜的状态的变化，导致其会发生大小以及曲线弯曲度的变化，所以相角频率曲线包含的信息更多，因此使用相位角数据进行下一步的分析。

细胞膜上存在多种离子通道，当这些通道受到适当的刺激或调节时，离子通道会开放，允许特定离子通过。这些离子的运动会形成电流，在细胞膜上产生电位变化，从而导致细胞膜的导电性增强。图4d-e分别展示了片状电极和针状电极的相位角测量结果。对阻抗谱曲线进行了特征的提取，图中的曲线呈“S”形分布，紧密分布，相互交叉。为了更好地研究这一区域，以针状电极为例，将图4e的红框区域放大，可明显的观察到不同时间下相角曲线的交叉(图4f)，这证明了区域内的相角斜率随时间变化，这里将其考虑为表示鲈鱼应激水平的形态学特征参数。在实际应用中，由于近似直线上相邻两点的斜率相差不大，因此在计算直线斜率时，自动定位直线端点比较复杂。但曲线的峰谷点总是唯一的。因此，用峰谷点代替直线端点来计算鲈鱼应激水平的形态特征参数如图4g所示。

片状电极和针状电极在不同频率下的形态特征参数（相角斜率）分别如图4h和图4i所示。片状电极由于贴附在鱼体上，其形态特征参数曲线相较于插入式的针状电极有些许锯齿。但总体来说两个形态特征参数曲线的趋势大致上是相同的，先上升，然后经历一段平稳期，接着下降，之后又是上升，最后再单调下降。且两个曲线的极值点出现的次数也较为一致。两个曲线均能分辨出鱼的不同阶段，但在电极选优的试验中，我们观察到作为插入式的针状电极的测试对象的鱼，相比于无损的贴附在鱼体表面的片状电极其进入濒死状态的时间要快，也就是说插入式的针状电极虽然数据较为稳定，固定性较好，但是其会影响鲈鱼的存活时间，因此我们最终选择无损的片状电极作为最优电极。

图 4：电极原理

为准确地识别鲈鱼应激水平的模式，我们分析了整个过程中血糖浓度和呼吸频率的变化，如图5a所示。在最初的3小时内，鲈鱼的血糖水平急剧下降。这种下降可能是鱼类对低温环境的反应，它们将体内储存的糖原转化为葡萄糖以对抗寒冷，导致血糖浓度降低。在3-5小时的时间段内，鲈鱼适应了低温环境，其代谢能力部分恢复，并导致血糖浓度反弹。在5-8小时内，随着鲈鱼适应环境，出现了轻微的应激反应，在这个反应过程中，细胞消耗葡萄糖生成ATP，导致血糖浓度短暂下降。在这种下降后，胰高血糖素的释放增加，促进肝糖原的分解和非葡萄糖物质转化为葡萄糖，最终提高了血糖水平。8小时后，鱼类经历了应激阶段，肌肉收缩减少，活动水平下降。随着鱼类接近死亡，心脏功能恶化，导致血糖水平进一步下降。

呼吸频率曲线表现出两个明显的趋势：上升和下降。在最初的3小时内，由于鱼类处于无水环境中，呼吸频率增加，以更快地获取氧气。在3-7小时内，由于对低温环境适应，呼吸频率逐渐降低。在7-8小时的时间段内，呼吸频率略微增加，可能是由于氧气耗尽、呼出气体积累和长时间暴露在无水环境中的原因。8小时后，随着氧气进一步消耗，鱼类继续在无水低温环境中持续存在，呼吸频率开始上升。在没有水和寒冷的环境下，鱼类逐渐失去活力，呼吸频率持续下降。结合在3.2.1节中分析的电极斜率曲线，可以将鲈鱼应激特征的变化划分为五个明显的阶段（图5b）。阶段一：（0~3h）急性应激阶段。个体进入无水低温的新环境后产生了较为剧烈的生理应激反应。此时鱼体增加了呼吸频率和呼吸强度来维持正常的需氧量。阶段二：（3~5h）体内调节阶段。随着个体对新环境运输胁迫的逐渐适应，机体生理应激反应逐渐趋向平稳。阶段三：（5~6h）适应应激阶段。在10h适应了环境的鲈鱼产生些许应激反应，身体出现些许应激的摆动。阶段四：（6~8h）累积应激阶段。进入应激期尾声，鲈鱼已经完全适应了运输环境，因此其生理指标逐渐稳定，也意味着鱼体处于深度休眠的状态。阶段五：（8~12h）濒死阶段。鲈鱼度过应激期，肌肉不再频繁收缩，其活动能力下降。同时呼吸困难，代谢率急剧下降。

图 5：应激性能

将阻抗幅值，阻抗相位角输入ANN模型，图6的子图左轴显示了模型的预测结果。预测数据集由A1-A5样本等距提取，目的是广泛测试不同节点的数据。图6a显示了综合因素影响下应激水平的预测结果，其具有鲜明的层次感，绝大部分预测等级均在真实值附近，只有少数数据点偏离整数值。图6b和c分别显示了以阻抗原始参数为输入和以形态学特征参数为输入的应激水平的预测结果，同样具有鲜明的层次感，大部分预测等级均在真实值附近，但偏离整数值的数据点数明显增多。值得一提的是，预测等级随着时间的增长呈逐渐增加的趋势，此时鱼感到越来越不舒服，并可能增加运输应激的概率或程度。

其中，鲈鱼在 0-3h 和6.5-8h的运输阶段内，应激水平变化幅度较大，受到外界环境胁迫的影响最明显，结合应激变化规律，应更多的在此阶段对鱼体应激水平进行干预及调节，以降低应激过激对鱼体质量的影响。结合应激水平的变化趋势可知，由于应激水平的累积作用，导致鲈鱼的阻抗特性在较高的运输胁迫下会随应激水平的升高而逐渐降低，应控制运输时间在8-10小时之内。模型的误差在图6的子图右轴显示。三种条件下数据的预测误差都接近零值线，说明模型具有较强的泛化能力。特别的，当绝对误差在0.3以内时，考虑综合因子作用的预测精确度高达95.98%，高于单一环境因子预测模型（94.71%）和生理因子预测模型（95.02%）。但同时，仍有4组数据的预测误差在1个等级以上，说明模型仍有待改进，但对整体预测精度影响不大。此外，预测集的预测精度与验证集的预测精度较为接近，表明模型的适应能力较强。该评价模型为活鱼的应激水平评价提供了参考。

图 6：预测性能

★  结论与展望

基于阻抗测量和数学建模方法，本文主要分析了无水低温环境下鲈鱼阻抗信息与鲈鱼应激水平的关系，提出了鲈鱼应激水平的预测方法。结果表明，片状同侧和铜材质的阻抗电极是持续监测鲈鱼生理阻抗信息的最佳电极，基于ANN的应激水平预测模型的精度高达93.98%，因此，它被认为适合实际应用。试验表明，随着运输时间的增长，鲈鱼的应激水平持续升高，最后直至濒死甚至死亡。试验过程中，应更多的在在 0-3h 和6.5-8h的运输阶段内对鱼体应激水平进行干预及调节，由于应激水平的累积作用，应控制运输时间在8-10小时之内。未来的工作可以研究提高输入/输出信息量对模型结果的影响，例如增加电极数量和降低扫频间隔，推动阻抗检测技术的发展与实际应用。此外，将致力于提升预测模型的精度和稳定性，以更好的控制和降低因应激而死亡的概率。

审核编辑：黄飞