基于DNA树突状探针的微流控免疫传感平台，用于过敏原标志物的高灵敏检测

过敏原特异性IgE（sIgE）是过敏原筛选和诊断中重要的过敏原标志物之一。近年来，食物过敏已成为一个全球性的健康问题。近年来，等温核酸扩增，如杂交链反应和滚动圈扩增，对提高生化传感器的灵敏度有显著的作用。鉴于核酸探针和相关扩增方法的多样性，各种自组装DNA纳米结构方案已经被设计出来，为实现敏感的生物分析带来了巨大的希望。然而，线性DNA纳米结构带来的信号放大效率是有限的。为了克服这一缺点，研究人员开发了分枝或树突状的非线性自组装DNA纳米结构。

因此，基于非线性自组装DNA纳米结构实现sIgE的高灵敏度检测是可能的。微流控芯片可以将基本操作单元集成到厘米级芯片上，在以患者为中心的医学发展中发挥着重要作用。为了实现便携即时检测，研究人员已经提出了各种芯片上的实验室免疫测定方法。然而，很少有免疫分析方法能够实现血液中敏感、准确和多种分析物的综合特征。

近期，华侨大刘斌、魏晓峰教授课题组报道了一种基于滚环扩增技术辅助DNA树突状分子探针的微流控免疫传感平台，用于灵敏检测多种sIgEs。相关成果以“Microfluidic Immunosensing Platform Based onRolling Circle Amplification-Assisted DNA Dendrimer Probe for Portable andSensitive Detection of Allergen-Specific IgE”为题发表在国际化学权威杂志Analytical Chemistry上。

在临床诊断中，捕获的抗原/抗体主要通过化学修饰固定在基底上。然而，这些方法可能导致捕获的抗原/抗体构象发生改变，甚至可能导致其蛋白活性降低。His6-tag与金属离子的高亲和力合作相互作用几乎是自发发生的，并且已被证明是一种强大的生物偶联策略。His6-tag由对Ni²⁺具有特殊亲和力的组氨酸残基组成。组氨酸侧链含有咪唑基团，能与Ni²⁺配合，促进His6-tag标记蛋白与Ni-IMAC磁珠结合。His6-tag的引入不仅保持了蛋白质结构，而且为捕获的抗原/抗体结合底物提供了额外的结合位点。在本研究中，这些过敏原N端或C端带有His6-tag并在大肠杆菌中重组表达。

在此基础上，研究人员提出了一种核酸扩增荧光生物传感器，利用核酸的碱基配对和特异性识别，组装DNA树突状分子，用于便携式循环检测sIgE。Ni-IMAC磁珠附着His6-tag标记的过敏原特异性识别和富集sIgE。DNA1与tDNA上的部分序列互补。通过与tDNA修饰的二抗免疫偶联，在sIgE存在的情况下，DNA1和DNA2作为探针可以被识别并吸引到磁珠上。tDNA与DNA1和DNA2杂交形成DNA树状前体。随后，由树突前体和粘端环状模板自组装获得树突状DNA。随后，随着RCA反应的进行形成最终的DNA树突探针。最终荧光染料SYBR Green I嵌入DNA树突探针最终产生强烈的荧光信号，实现sIgE的灵敏分析。

此外，组氨酸残基具有咪唑基团，能与Ni²⁺、Co²⁺等过渡金属离子形成配位键。这些金属离子可以通过螯合配体固定在色谱介质上。当向缓冲溶液中加入高浓度的咪唑时，咪唑会与His6-tag的蛋白竞争Ni²⁺的结合位点，具有镍配位的His6-tag标记蛋白将被洗脱。因此，基于DNA树突的免疫传感器具有良好的可逆性，可用于多次分析。

钙钛矿纳米晶形状控制合成示意图  

综上所述，该研究将Ni-IMAC磁珠和DNA树突探针集成到基于多通道微流控血液分析装置的荧光免疫分析中，用于sIgE的定量分析。该策略包括以下进展：

（1）多通道芯片能够同时检测多个目标；

（2）荧光染料介导的DNA树状大分子扩增荧光信号，实现高灵敏度，LOD在25-50 pg/mL；

（3）基于His6-tag的Ni-IMAC磁珠免疫试验具有良好的可逆性；

（4）mcWBAD滤过血细胞直接检测全血样本。

此外，该策略中使用His6-tag和Ni-IMAC磁珠有效地减少了假阳性信号，这对于准确的sIgE分析至关重要。由于能够根据sIgE水平区分牡蛎致敏患者和健康志愿者，显示出该方法在食物过敏诊断方面具有重要的潜力。

论文链接： https://doi.org/10.1021/acs.analchem.4c00255  

 

审核编辑：刘清