用于定量相位和散射成像的透射结构照明显微镜

 

定量相位显微镜（QPM）利用物波的相位信息，不仅可以提供相差图像，还可以提供样品三维形貌和折射率分布的定量信息。

更高的空间分辨率有利于解析样本的更精细细节。然而，在设计显微物镜时，通常需要在更高的空间分辨率和更小的视场（FOV）之间取得平衡。结构照明显微镜（SIM）是一种宽视场、微创、超分辨率成像技术，可以将无法分辨的高频信息降档为系统支撑区域的低频下降，如图1所示。

图 1 

此外，SIM还被证明具有与共聚焦显微镜相当的光学切片能力。因此，SIM在生物医学成像中得到了广泛的应用，特别是活细胞的长期观察动力学。到目前为止，具有结构照明的QPM已经使用光栅或空间光调制器（SLM）实现，并且相位成像模式通常与其他成像模式（如荧光成像）隔离开来。因此，由于同一样本缺乏多维信息，QPM的值受到限制。

在本文中，我们提出了一种基于DMD的光学显微镜，它集成了多种成像模式。首先，基于结构照明的QPM能够在没有荧光标记的情况下提供样品的定量相位图像。其次，相干SIM提供具有分辨率增强的未标记样品的吸收/散射图像。第三，该系统与荧光成像模式集成，可提供同一样品的额外（功能/生化）信息。

系统原理

该系统的原理图如图2所示，使用二极管激光器作为照明源。在依次被反射镜M1和M2反射后，激光束被耦合到光纤中并发送到装置。在输出端，来自光纤的光被镜头L1准直，并由反射镜M3引导至DMD（UPOLabs的HDSLM756D空间光调制器，1920×1080像素，像素大小7.56μm），入射角为24°。在DMD上，两组具有正交方向和五相位移的条纹图案依次加载到DMD中。DMD上显示的条纹图案由望远镜系统L2-L3和L4-MO1进一步中继，并最终投射到放置在MO1和MO2公共焦平面上的样品上。

在条纹照明下，然后由望远镜系统MO2-L5将样品成像到图像平面。相机CCD1记录不同成像模式的衍射图像，qDIC中的散焦图像和相干SIM中的聚焦图像。同时，来自样品的发射光（荧光）将沿照明光的相反方向传播，然后被相机CCD2收集。相机CCD1和CCD2与DMD同步，产生每秒15帧的采集速度，为每个通道提供亚秒级的成像速度。

图 2

实验与结果

qDIC活细胞显微镜成像

在第一个实验中，进行了验证性实验，以证明在没有荧光标记的情况下对活样品成像的qDIC。为此，使用活小鼠脂肪干细胞作为相样。实验结果如图3所示，通过比较表明，qDIC不仅可以可视化高对比度的透明样品，还可以为我们提供样品光程差（OPD）的定量信息。

图 3  小鼠脂肪干细胞的qDIC成像。

SiO2 颗粒的相干 SIM 成像

在第二个实验中，通过对SiO2磁珠（直径：500 nm）进行成像，证明了使用相干结构照明的分辨率增强非荧光/散射成像。 实验结果如图4所示.很明显，相干结构照明在SiO2磁珠上提供了高分辨率图像。 

图 4  500nm SiO2 磁珠的相干 SIM 成像。

百合花药的双模态（散射/荧光）成像

在第三个实验中，以百合花药为样本，展示了所提出的SIM装置的双模态（非荧光散射/荧光）成像能力。实验结果如图5所示.荧光图像经彩色滤光片滤波后由相机CCD2捕获，与使用均匀照明获得的宽视场图像相比，SIM图像显示出更详细的结构和更清晰的背景。此外，荧光图像在干净的背景中显示了清晰的花粉结构（具有自发荧光）。SIM图像（透射）和荧光图像（反射）对于同一样品具有相反的对比度，这一点也很明显。

图 5 百合花药的双模态成像。

审核编辑：刘清