高灵敏度，大幅面CCD摄像机可实现土壤生长根系统的多维表征

　　最近，一支来自北美和欧洲的科学家团队开发了一种创新的生长和成像平台，称为 GLO-Roots，可以研究土壤生长植物的根系结构和基因表达。

　　GLO-Roots是卡内基科学研究所(加利福尼亚州斯坦福)的 José Dinneny 博士实验室、Rubén Réllan-Álvarez 博士(墨西哥朗格比奥)和比利时列日大学的 Guillaume Lobet 博士实验室的合作成果。研究人员在 BioImaging Solutions, Inc.(加利福尼亚州圣地亚哥)的帮助下设计和建造了新的生长和成像平台，支持几种模式生物，即拟南芥、二穗短柄草、狗尾草和番茄。

　　GLO-Roots 采用基于发光的报告子和一对普林斯顿仪器背照式 CCD 相机，用于研究土壤中生长的遮光根的根结构和基因表达模式。定制设计的图像分析算法允许对土壤特性、基因表达和根系结构特征进行空间整合。GLO-Roots 开发人员声称，新平台可以提供巨大的实用性，以唤起自然的适应性反应的方式向根系呈现环境刺激，并提供研究此类过程多维性质的工具。

　　本应用说明将概述 GLO-Roots 团队进行的一些研究，该团队由斯坦福大学卡内基科学研究所植物生物学系的 José Dinneny 博士领导

　　GLO-Roots 设置

　　GLO-Roots 平台由 四部分组成：(1)生长容器，称为根管，允许植物在土壤中生长并对根部进行成像;(2)基于发光的报告器，可以追踪活植物根部生物学的各个方面;(3) GLO1，一种旨在自动对根管进行成像的发光成像系统; ( 4 ) GLO-RIA，一种旨在量化利用 GLO1 成像的根系的图像分析套件。2图 1 显示了使用 GLO-Roots 平台的实验设置示例。

　　图 1. GLO-Roots 生长和成像系统。(A)根管不同物理组件的三维表示，包括塑料盖、聚碳酸酯板、垫片和橡胶 U 型通道。(B)根管中 35 天大的植物，黑色盖子已移除。(C)带有 11 个根管的容纳箱的顶视图。(D)本研究中使用的不同荧光素酶的体内发射光谱。表达所示转基因的转基因纯合株系在琼脂培养基上生长 8 天。将荧光素 (300 μM) 喷洒在幼苗上;将培养皿放在黑暗中，然后在 500 至 700 nm 的波长范围内成像 2 秒。从不同幼苗根部的不同部位获取五个强度值并取平均值。相对比较大强度值显示在右下图中。(E) GLO1 成像系统由两台Princeton Instruments PIXIS:2048 背照式 CCD 相机 (a)组成，冷却至 -55°C。滤光轮(b)允许对不同的荧光素酶进行光谱分离。右侧是根管支架(c)用于将根管器定位在摄像机前面。步进电机(d)将根管器旋转 180° 以对两侧进行成像。(F)在根管器的两侧分别对表达报告基因 ProUBQ10:LUC2o 的 21 DAS(即播种后 21 天)植物进行成像;发光信号以绿色或洋红色表示侧面。面板中间显示了两侧的组合图像。插图显示了根系的放大部分。

　　图表、照片和数据由卡内基科学研究所的 José Dinneny 博士提供。首次发表于 R. Rellán-Álvarez 等人 2015 年。“GLORoots：一种能够多维表征土壤生长根系的成像平台。”eLife 4 (1): e07597。

　　虽然大多数用于生物医学研究的商用发光成像系统都针对水平放置的标本或微量滴定板中的样品进行了优化，但将根管置于此位置会引发植物的重力反应。因此，GLO-Roots 使用定制设计的成像系统(称为生长和发光观测站 1，或简称为 GLO1)，该系统已针对GLO-Roots 根管中的双报告荧光素酶表达进行了优化。

　　两台PIXIS:2048 背照式 CCD 相机(来自普林斯顿仪器公司)相互叠放，以便捕捉根管的部分重叠图像，同时电动平台自动旋转根管以捕捉两侧的图像(参见图 1E)。然后根据捕捉到的两侧图像生成合成图像。图 1F 显示，每侧大约有一半的根系显露出来，两侧都有一些根系可见。土壤层足够厚，可以阻挡部分根系的光线，但又足够薄，可以确保其连续结构可以从对面视图进行编译。整个 GLO1 成像系统封闭在一个不透光的黑匣子中，该黑匣子配有门，可以装载和卸载根管。

　　PIXIS:2048B 相机不仅为 GLO-Roots 研究人员提供了所需的空间分辨率和视野，还提供了检测所用不同报告基因的发射波长所需的出色低光照灵敏度。表 1 列出了用于拟南芥相关 GLO-Roots 研究的荧光素酶。

　　数据和结果

　　根系会发育出不同的根系类型，每种根系都能感知无数的局部环境线索，并将其环境信息与系统信号整合在一起。这种高度复杂的多维输入融合使得根系生长速度、方向和代谢活动能够不断调整，从而形成一个动态的物理网络。

　　图 2 展示了使用 GLO1 系统捕获的拟南芥根系的延时成像以及使用 GLO-RIA 图像分析套件进行的量化。

　　图 2. 拟南芥根系延时成像并使用 GLO-RIA 进行量化。(A)ProUBQ10:LUC2o Col-0 植物的典型每日延时图像系列(11 至 35 DAS)。(B)使用 GLO-RIA 中实现的方向性插件计算出按时间序列成像的三个根系的平均方向性(如图 A 所示)。(C)使用图 A 中的图像对根系生长进行颜色编码投影。(D)根系深度、宽度和面积是根据凸包自动计算的，凸包由 GLO-RIA(n = 3)半自动确定。手动量化了主根长度、侧根数以及侧根数除以主根长度。使用具有 95% 置信区间(灰色)的局部多项式回归拟合来表示方向性分布曲线。0° 是重力矢量的方向。

　　图表、照片和数据由卡内基科学研究所的 José Dinneny 博士提供。首次发表于 R. Rellán-Álvarez 等人 2015 年的论文“GLORoots：一种能够多维表征土壤中生长的根系的成像平台。”eLife 4 (1): e07597。

　　在这里，可以通过植物发育的后期阶段观察到方向性等根系特征(注意图 2A 和 2B 中分别显示的 35 DAS 根系图像和 35 DAS 方向性分析)。图 2A 和图 3 显示了播种后11 至 21 天的拟南芥种质 Col-0 根表达报告基因 ProUBQ10:LUC2o 的时间序列;图 2C 显示了颜色编码的时间投影。

　　方向性分析表明，随着侧根成为主要根系类型，根系角度逐渐变化，从 0°(垂直)到 55°。图 2D 显示了GLO-RIA 可以自动捕获的几种根系特征(深度、宽度、面积)以及手动量化的其他特征(主根生长率或每个主根的侧根数量)随时间的变化。

　　到目前为止，GLO-Roots 团队已经发表了关于根系生长连续成像的数据;不同拟南芥种质的根系结构;利用光谱上不同的荧光素酶来捕获与基因表达模式、根系相互作用表征和微生物定植相关的其他信息;在缺水、缺磷和光照条件下根系结构的适应性变化; GLO-Roots 平台是否适合研究其他植物物种;等等。研究团队还对发现其他环境刺激如何影响根系生长以及这些反应在拟南芥不同种质之间是否不同非常感兴趣。

　　图 3：在对照条件下生长的表达 ProUBQ10:LUC2o 的 Col-0 植物从 11 天到 21 天的视频延时时间戳。视频由卡内基科学研究所的 José Dinneny 博士提供。首次发表于 R. Rellán-Álvarez 等人 2015 年。“GLO-Roots：一种能够多维表征土壤生长根系的成像平台。”eLife 4 (1): e07597。

　　欲了解更多数据和深入讨论结果，请参阅 R. Rellán-Álvarez 等人 2015 年的论文“ GLO-Roots：一个能够多维表征土壤中生长的根系的成像平台。 ”eLife 4 (1): e07597。

　　使能技术

　　GLO1 成像系统中集成的每台PIXIS:2048 相机均采用背照式传感器 CCD，其大型感光阵列由2048 x 2048 像素组成(见图 3)。通过采用普林斯顿仪器独有的XP 冷却技术，这些四百万像素相机通过全金属密封设计实现了低至 -70°C 的热电冷却。这种创新的冷却技术可确保免维护运行 ，并由业内唯一的终身真空保证提供支持。

　　图 4：普林斯顿仪器公司的 PIXIS：2048 CCD 相机具有出色的灵敏度和宽阔的视野。

　　除了 XP 有助于很大程度地减少热产生的(暗)噪声外，极高的量子效率和超低噪声电子元件使 PIXIS:2048 相机成为要求严格的低光照成像应用的理想选择。双速操作(即 100 kHz 或 2 MHz)允许在稳态和快速动力学研究中使用。

　　为了优化从 UV 到 NIR 应用的定量科学成像性能，PIXIS:2048 平台支持前照式CCD 格式、背照式格式、具有高 UV 灵敏度的背照式格式以及具有高 NIR 灵敏度的背照式格式(请注意，普林斯顿仪器利用其专有的eXcelon® 处理和背照式深耗尽技术，在 NIR 中提供比较高灵敏度，同时抑制标准背照式 CCD 中发生的 etaloning)。PIXIS 系列支持其他几种适用于各种成像和光谱应用的 CCD 阵列尺寸。

　　使用普林斯顿仪器公司最新版的 64 位 LightField® 数据采集软件(可选)可以轻松完全控制所有 PIXIS 硬件功能。通过极其直观的 LightField 用户界面，可以实现一系列新功能，轻松捕获和导出图像数据。

审核编辑 黄宇