光束匀化在荧光成像平场照明中的应用

荧光显微镜

 

荧光显微镜属于光学显微镜家族，基于荧光的物理效应。利用了所谓的荧光染料的颜色特性，它们被特定波长的光激发，并以不同的波长再次反射吸收的光。

荧光显微镜的应用

 

荧光显微镜可以进行形态学研究、纳米范围内的测量值分析以及实时可见的大多数不同文化的过程。无论是在生物化学、生物物理学还是医学领域：快速、详细地检测明亮、多彩的荧光有助于荧光显微镜的测量过程，并为新发现奠定基础。最佳测量结果和最佳分辨率需要最精确的光学器件——无论是通过光束路径的优化和聚焦、精确安装的滤光片还是高质量的镀膜。

 

 

荧光显微镜的结构和功能原理

 

允许个别波长通过的特殊滤光片可确保荧光显微镜下荧光的可视化。荧光显微镜的特殊滤光片包括：
 

励磁滤波器

 

 

发射过滤器

 

 

二向色分束器

 

 

单独的激发滤光片允许相应波长的光通过，这是激发待检样品中特定染料所必需的。二向色镜将刺激波长反射到物镜，物镜将光束集中到标本上。从标本反 射的光集中在物镜中，在其激发态通常具有比入射光更高的波长。通过二向色镜，反射光通过发射滤光片并降低到发射波长。尚未在二向色镜处停止的刺激光的残留物在发射滤光片处被过滤掉。理想情况下，只有发射光撞击显微镜内置的检测器，并以相应的颜色可见。最佳测量结果需要均匀的照明，尤其是当需要几微米或几毫米的大视野时。在不均匀照明的情况下，例如，可能发生待检查分子的不均匀激活。结果：中心的分子比入射照明光束外围的分子发出更强烈的荧光。如果周边没有与中心等同地照亮，则当单独记录的图像网格稍后合并时，阴影继续出现。因此，细胞和组织样本等测量不能用于可靠的分析。这些问题可以通过使用 a|TopShape a|BeamExpander 来解决。通过使用非球面可以实现这些元素在系统中。我们的系统以其紧凑的设计、精度和最高的光学质量而令人信服。使用光学组件a|TopShape 和 a|BeamExpander 可以将高斯光束转换为均匀的平顶轮廓，从而在整个视野中实现均匀照明。所产生的平场照明具有高空间相干性、无与伦比的光学性能和 > 95% 的高均匀性。分子的均匀激发和最小的图像重叠 (5%) 可以保证让您完全满意。

 

 

下图显示了荧光显微镜的工作原理和一般结构。

 

 

荧光显微镜的工作原理

荧光显微镜应用

 

基于激光的荧光显微镜内的定量分析可能会因高斯光束轮廓产生的不均匀 照明而变得复杂。光源和照明光学等因素会影响均匀性。当要检查大视野 (FOV)时，这些功能尤其具有挑战性。测量图像由图像网格在荧光显微镜中生成。以边缘重叠的方式获取单个图像，并且可以在后处理中组合它们。如果照明不均匀，最终图像的每个单独图像周围都会有变暗的边缘 - 细胞和组织样本的测量变得不可靠。光照不均匀的另一个缺点：分子激活不均匀。那些靠近光束中心的荧光比边缘的荧光更多。位于奥兰多的中佛罗里达大学光学与光子学院的一个研究团队通过将aphericon 的光束整形器 a|TopShape 和 a|BeamExpander 集成到显微镜装置中，从而克服了这些问题。平场照明 (FFI) 设置将高斯光束塑造成统一的平顶轮廓。a|TopShape 对入射激光束大小的变化具有极高的容忍度 (± 10 %)，并且以消色差方式运行。非常好的光学性能（均匀性 > 95%）可实现均匀照明，从而激活分子。此外，FFI 设置可实现无边界拼接成像，图像重叠最小 (5%)。

 

 

定量荧光成像的平场照明

 

项目介绍：

 

高斯轮廓的不均匀光照使得基于激光的宽视场荧光显微镜的定量分析具有很高的挑战性。许多因素，包括光源和照明光学有助于均匀性。当需要几百微米或毫米尺度的大视场时，这些特性尤其困难。获得一个图像网格，使边界重叠，并在后处理中将图像拼接在一起。如果光照不均匀，最终拼接的图像在每个单独的图像周围都有暗淡的边界。因此，细胞和组织样本的测量是不可靠的。非均匀光照的另一个缺点是分子的不均匀激活。那些最靠近光束中心的人比那些靠近边缘的人荧光更强烈。

 

 

项目实施：

 

来自美国佛罗里达州奥兰多市中佛罗里达大学光学与光子学学院的一个研究团队，在他们的显微镜设置中使用非球面 TopShape 和 BeamExpander 时，可以克服这些问题(b)，这两个都是由非球面组成的非常紧凑和高精度的折光光学组件。因此，他们能够呈现平场照明(FFI)，其中高斯光束被塑造成一个均匀的平顶轮廓(a)。光束整形装置非常容忍入射激光束的大小变化，接受±10%，同时也是消色差的(e)。FFI 的工作距离(f)长，空间相干性高，可以在多色单分子成像中实现均匀的 epi1 和 TIRF2 照明。所使用的光学器件具有无与伦比的光学性能，均匀性> 95%，允许均匀的照明(c & d)，从而均匀地激活分子。此外，FFI 实现了最小图像重叠(5%)的无界缝合成像。

说明: 1,外延照明模式是指从样品的一侧进行照明和检测;