荧光分光度计的应用用途_荧光分光度计原理_荧光分光度计使用步骤

摘要：荧光分光光度计生物化学、生物医学、环境化工已经得到普遍的运用，本文主要介绍了荧光分光光度计功能特点、荧光分光光度计分类和优缺点分析、其次介绍了荧光分光光度计产品应用及用途和它的原理，最后介绍了荧光分光度计使用的详细步骤。

荧光分光光度计功能特点

1． 荧光发射光谱

选择某一固定波长的光激发样品，记录样品中产生的荧光发射强度与发射波长间的函数关系，即得荧光发射光谱。

2． 荧光激发光谱

选定某一荧光发射波长记录荧光发射强度作为激发光波长的函数，即得荧光激发光谱。

3．时间分辨技术；

可用于对混合物中光谱重叠但有寿命差异的组分进行分辨并分别测量。

时间分辨荧光测定公式如下：

P（t） = P0 EXP （-t /τ）

式中P（t）：拟合指数函数

P0：强度取值

EXP：指数运算符

t：时间取值

τ：荧光平均时间寿命

 

荧光分光光度计分类

荧光光谱法具有灵敏度高、选择性强、用样量少、方法简便、工作曲线线形范围宽等优点，可以广泛应用于生命科学、医学、药学和药理学、有机和无机化学等领域。

荧光分光光度计的发展经历了手控式荧光分光光度计，自动记录式荧光分光光度计，计算机控制式荧光分光光度计。

光分光光度计三个阶段;荧光分光光度计还可分为单光束式荧光分光光度计和双光束式荧光分光光度计两大系列。其他的还有低温激光Sh p ol’skill荧光分光光度计，配有寿命和相分辩测定的荧光分光光度计等。

 

荧光分光光度计优缺点

优点：

灵敏度高，可以用于扫描液相荧光标记物所发出的荧光光谱，不但可以做一般的定量分析， 而且还可以推断分子在各种环境下的构象变化， 从而阐明分子结构与功能之间的关系。

缺点：

1、荧光的光强并不高，所以呈线性情况有时不很理想；

2、某些反应荧光持续的时间较短；

3、荧光的发散方向不集中，不像透射光那样集中，强度高；

4、受某些离子的干扰影响，荧光会湮灭，试验速度必须要快。

荧光分光光度计主流产品

上海棱光生产的F96系列、F97系列荧光分光光度计、顶级F98荧光分光光度计；

天津港东生产的F-380型、F-320型、F-280型荧光分光光度计；

天津拓普生产的WFY-28型荧光分光光度计；

上海三科生产的970CRT型荧光分光光度计；

荧光分光光度计产品应用及用途

对经光源激发后产生荧光的物质或经化学处理后产生荧光的物质成份分析，可应用于生物化学、生物医学、环境化工等部门。

荧光分光光度计是用于扫描液相荧光标记物所发出的荧光光谱的一种仪器。其能提供包括激发光谱、发射光谱以及荧光强度、量子产率、荧光寿命、荧光偏振等许多物理参数，从各个角度反映了分子的成键和结构情况。通过对这些参数的测定， 不但可以做一般的定量分析， 而且还可以推断分子在各种环境下的构象变化， 从而阐明分子结构与功能之间的关系。荧光分光光度计的激发波长扫描范围一般是190~650nm，发射波长扫描范围是200~800nm。可用于液体、固体样品（如凝胶条、粉末）的光谱扫描。

 

荧光分光光度计的原理

由高压汞灯或氙灯发出的紫外光和蓝紫光经滤光片照射到样品池中，激发样品中的荧光物质发出荧光，荧光经过滤过和反射后，被光电倍增管所接受，然后以图或数字的形式显示出来。

物质荧光的产生是由在通常状况下处于基态的物质分子吸收激发光后变为激发态，这些处于激发态的分子是不稳定的，在返回基态的过程中将一部分的能量又以光的形式放出，从而产生荧光。

不同物质由于分子结构的不同，其激发态能级的分布具有各自不同的特征，这种特征反映在荧光上表现为各种物质都有其特征荧光激发和发射光谱，因此可以用荧光激发和发射光谱的不同来定性地进行物质的鉴定。

在溶液中，当荧光物质的浓度较低时，其荧光强度与该物质的浓度通常有良好的正比关系，即IF=KC，利用这种关系可以进行荧光物质的定量分析，与紫外-可见分光光度法类似，荧光分析通常也采用标准曲线法进行。

荧光分光度计使用步骤

1.开机：接通电源，打开主机开关，点燃（打开）光源后，根据说明书要求启动计算机。

2.检测前准备：参照仪器说明书，在20天内至少进行一次激发校准和发射校准，检测前仪器应预热。

3.工作条件的选择：环境温度应在20℃±5℃;相对湿度不大于70%;电源稳定，无磁场、电场干扰。根据样品的特性及荧光强度，选择合适的仪器工作条件（如狭缝、PM增益、响应时间等）。

4.基本测定

（1）荧光激发光谱测定

设置仪器参数，扫描发射波长，找到maxλem，以此为发射波长，记录发射强度作为激发波长的函数，便得到激发光谱。

（2）荧光发射光谱测定

设置仪器参数，扫描激发波长，找到maxλex，以此为激发波长，记录发射强度与发射波长间的函数关系，便得到荧光发射光谱。

（3）差谱测定

设置仪器参数，选择合适的工作方式，测定背景溶液的发射光谱并储存起来，在一定的工作方式下，扫描样品溶液的发射波长，得到当时的光度值和储存的背景值之间的差示值，即差谱。

（4）峰面积积分

选择适当的工作方式，对样品溶液进行积分操作，即得到峰面积积分。

（5）荧光强度

选择合适的测量参数，设置λex、λem，采用定点读数或扫描方式，即可测得所选波长处的荧光强度。

（6）定量测定

配制一系列已知浓度的标准溶液，在一定的测定条件下，设置λex、λem，按照由稀至浓的次序，测定标准溶液的荧光强度，绘制荧光强度—浓度的工作曲线，不改变仪器参数测定未知溶液的荧光强度，由工作曲线即可求出未知溶液的浓度。