高通量测序技术及原理介绍

高通量测序技术（High-throughput sequencing）又称“下一代”测序技术（“Next-generation” sequencing technology），以能一次并行对几十万到几百万条DNA分子进行序列测定和一般读长较短等为标志。

高通量测序技术应用

测序技术推进科学研究的发展。随着第二代测序技术的迅猛发展，科学界也开始越来越多地应用第二代测序技术来解决生物学问题。比如在基因组水平上对还没有参考序列的物种进行从头测序（de novo sequencing），获得该物种的参考序列，为后续研究和分子育种奠定基础；对有参考序列的物种，进行全基因组重测序（resequencing），在全基因组水平上扫描并检测突变位点，发现个体差异的分子基础。在转录组水平上进行全转录组测序（whole transcriptome resequencing），从而开展可变剪接、编码序列单核苷酸多态性（cSNP）等研究；或者进行小分子RNA测序（small RNA sequencing），通过分离特定大小的RNA分子进行测序，从而发现新的microRNA分子。在转录组水平上，与染色质免疫共沉淀（ChIP）和甲基化DNA免疫共沉淀（MeDIP）技术相结合，从而检测出与特定转录因子结合的DNA区域和基因组上的甲基化位点。

这边需要特别指出的是第二代测序结合微阵列技术而衍生出来的应用--目标序列捕获测序技术（Targeted Resequencing）。这项技术首先利用微阵列技术合成大量寡核苷酸探针，这些寡核苷酸探针能够与基因组上的特定区域互补结合，从而富集到特定区段，然后用第二代测序技术对这些区段进行测序。目前提供序列捕获的厂家有Agilent和Nimblegen ，应用最多的是人全外显子组捕获测序。科学家们目前认为外显子组测序比全基因组重测序更有优势，不仅仅是费用较低，更是因为外显子组测序的数据分析计算量较小，与生物学表型结合更为直接。

目前，高通量测序开始广泛应用于寻找疾病的候选基因上。内梅亨大学的研究人员使用这种方法鉴定出Schinzel-Giedion 综合征中的致病突变，Schinzel-Giedion综合征是一种导致严重的智力缺陷、肿瘤高发以及多种先天性畸形的罕见病。他们使用Agilent SureSelect序列捕获和SOLiD对四位患者的外显子组进行测序，平均覆盖度为43倍，读长为50 nt，每个个体产生了2.7-3 GB可作图的序列数据。他们聚焦于全部四位患者都携带变异体的12个基因，最终将候选基因缩小至1个。而贝勒医学院基因组测序中心也计划对15种以Science杂志年度十大科学突破上疾病进行研究，包括脑癌、肝癌、胰腺癌、结肠癌、卵巢癌、膀胱癌、心脏病、糖尿病、自闭症以及其他遗传疾病，以更好地理解致病突变以及突变对疾病的影响。前不久刚刚结束的评选中，外显子组测序名列其中。

以上我们盘点了2010年第二代测序技术的最新进展和相关应用。但是除了第二代测序之外，还有另外一种以单分子实时测序和纳米孔为标志的第三代测序技术也正在如火如荼的发展中，只是还没有正式发布。所以目前科学界所说的高通量测序还指的是第二代测序。

一、测序技术发展现状

根据发展历史、影响力、测序原理和技术不同等，主要有以下几种：大规模平行签名测序（MassivelyParallel Signature Sequencing， MPSS）、聚合酶克隆（Polony Sequencing）、454焦磷酸测序（454 pyrosequencing）、Illumina（Solexa）sequencing、ABI SOLiD sequencing、离子半导体测序（Ion semiconductor sequencing）、DNA纳米球测序 （DNA nanoballsequencing）等。

随着第二代测序技术的迅猛发展，科学界也开始越来越多地应用第二代测序技术来解决生物学问题。比如在基因组水平上对还没有参考序列的物种进行重头测序（de novosequencing），获得该物种的参考序列，为后续研究和分子育种奠定基础;对有参考序列的物种，进行全基因组重测序（resequencing），在全基因组水平上扫描并检测突变位点，发现个体差异的分子基础。在转录组水平上进行全转录组测序（wholetranscriptome resequencing），从而开展可变剪接、编码序列单核苷酸多态性（cSNP）等研究;或者进行小分子RNA测序（small RNAsequencing），通过分离特定大小的RNA分子进行测序，从而发现新的microRNA分子。在转录组水平上，与染色质免疫共沉淀（ChIP）和甲基化DNA免疫共沉淀（MeDIP）技术相结合，从而检测出与特定转录因子结合的DNA区域和基因组上的甲基化位点。

二、高通量测序技术的应用

测序技术推进科学研究的发展。随着第二代测序技术的迅猛发展，科学界也开始越来越多地应用第二代测序技术来解决生物学问题。比如在基因组水平上对还没有参考序列的物种进行重头测序（de novosequencing），获得该物种的参考序列，为后续研究和分子育种奠定基础;对有参考序列的物种，进行全基因组重测序（resequencing），在全基因组水平上扫描并检测突变位点，发现个体差异的分子基础。在转录组水平上进行全转录组测序（whole transcriptomeresequencing），从而开展可变剪接、编码序列单核苷酸多态性（cSNP）等研究;或者进行小分子RNA测序（small RNA sequencing），通过分离特定大小的RNA分子进行测序，从而发现新的microRNA分子。在转录组水平上，与染色质免疫共沉淀（ChIP）和甲基化DNA免疫共沉淀（MeDIP）技术相结合，从而检测出与特定转录因子结合的DNA区域和基因组上的甲基化位点。

需要特别指出的是第二代测序结合微阵列技术而衍生出来的应用--目标序列捕获测序技术（Targeted Resequencing）。这项技术首先利用微阵列技术合成大量寡核苷酸探针，这些寡核苷酸探针能够与基因组上的特定区域互补结合，从而富集到特定区段，然后用第二代测序技术对这些区段进行测序。目前提供序列捕获的厂家有Agilent和Nimblegen，应用最多的是人全外显子组捕获测序。科学家们目前认为外显子组测序比全基因组重测序更有优势，不仅仅是费用较低，更是因为外显子组测序的数据分析计算量较小，与生物学表型结合更为直接。

目前，高通量测序开始广泛应用于寻找疾病的候选基因上。内梅亨大学的研究人员使用这种方法鉴定出Schinzel-Giedion 综合征中的致病突变，Schinzel-Giedion综合征是一种导致严重的智力缺陷、肿瘤高发以及多种先天性畸形的罕见病。他们使用AgilentSureSelect序列捕获和SOLiD对四位患者的外显子组进行测序，平均覆盖度为43倍，读长为50 nt，每个个体产生了2.7-3GB可作图的序列数据。他们聚焦于全部四位患者都携带变异体的12个基因，最终将候选基因缩小至1个。而贝勒医学院基因组测序中心也计划对15种以上疾病进行研究，包括脑癌、肝癌、胰腺癌、结肠癌、卵巢癌、膀胱癌、心脏病、糖尿病、自闭症以及其他遗传疾病，以更好地理解致病突变以及突变对疾病的影响。前不久刚刚结束的Science杂志年度十大科学突破评选中，外显子组测序名列其中。

三、测序技术总结与展望

第一代测序技术凭借其长的序列片段和高的准确率，适合对新物种进行基因组长距框架的搭建以及后期GAP填补，但是成本昂贵，而且难以胜任微量DNA样品的测序工作。第二代测序技术中，454序列片段最长，比较适合对未知基因组从头测序，搭建主体结构，但是在判断连续单碱基重复区时准确度不高。Solexa较454具有通量高、片段短、价位低的特点，可以用于大基因组和小基因组的测序和重测序。Solexa双末端测序（paired-end sequencing）可以为基因组进一步拼接提供定位信息，但是随着反应轮数增加，序列长度和质量均有所下降，而且在阅读AT区时有明显错误倾向。SOLiD基于双碱基编码系统的纠错能力以及较高的测序通量，适合转录本研究以及比较基因组学特别是SNP检测等，但是测序的片段短限制了该技术在基因组拼接中的广泛应用。第三代测序技术目前正在研发阶段，尚未正式投入使用。