一种用于尿液中BA实时检测的纳米光子学生物传感平台

近年来，由食源性细菌毒素引发的公共卫生事件频繁发生。其中，米酵菌酸（Bongkrekic acid，BA）因其极强毒性和较高病死率而备受关注。该毒素主要由椰毒假单胞菌产生，常见于变质发酵食品、木耳制品及米制品中。由于其耐热、难挥发，即使经过常规烹饪也无法被有效去除。

研究显示，米酵菌酸通过抑制线粒体ATP合成导致细胞能量代谢崩溃，可引发呕吐、腹痛、乏力、多器官衰竭等严重症状。其在人类中的致死剂量极低，死亡率甚至可超过40%。近年来，中国及东南亚地区多次报道相关中毒事件，使得该毒素检测成为食品安全与临床毒理学的重要课题。

然而，目前主流检测方法主要依赖LC-MS/MS、UHPLC-MS/MS等大型仪器平台。这些方法虽然灵敏度高，但存在设备昂贵、操作复杂、检测周期长、难以现场部署等问题，无法满足临床快速诊断与基层应急筛查需求。

在这一背景下，华南农业大学联合西班牙加泰罗尼亚纳米科学与纳米技术研究所（ICN2）等研究团队，提出了一种新的 BA 检测策略，该策略采用通过将噬菌体展示选择的 BA 表位与麦芽糖结合蛋白 (MBP) 融合而生成的重组抗原模拟物，从而无需处理天然毒素即可实现安全、可重复和可扩展的免疫测定开发。

Figure 1. Schematic overview of the integration of biosynthetic toxin mimetics with a nanophotonic biosensor for real-time detection of BA in urine. (A) Design of the expression plasmid for BA-MBP fusion protein; (B) Design of the competitive biosensor assay based on the covalent immobilization of BA-MBP fusion protein.

BA-MBP 融合蛋白在竞争性免疫测定 (ic-ELISA) 中用作包被抗原，显示出灵敏的抗体识别能力，测定 IC50 为 6.24 ng/mL。

这种方法被进一步转化为纳米光子无标记生物传感平台，以展示人体样本快速诊断的潜力。

Figure 2. Construction of the BA-MBP fusion protein. (A) Schematic diagram of the BA-MBP recombinant vector. (B) Colony PCR screening. M: DL 5000 DNA marker, lanes 1−16 were single colonies picked from the pMAL-pIII-BA-MBP.

Figure 5. Performance of the nanophotonic biosensor-based BA immunoassay. Real-time biosensor responses for competitive immunoassay in PBST (A) and 1:5 urine (B). (C) Calibration curves for BA detection in PBST and 1:5 urine. (D) Correlation between the nanophotonic biosensor and LC-MS/MS for the analysis of BA in blind-spiked urine samples. Each point represents the mean ± SD of three replicates.

单步竞争性生物传感器测定的 IC50 为 0.64 ng/mL，检测限为 0.12 ng/mL，比使用传统缀合物的 ic-ELISA 提高了 10 倍，并提供与 LC-MS/MS 相当的性能。该方法在加标盲尿样本中成功得到验证，突出了其在临床相关基质中的适用性。 

BA-MBP 融合缀合物与光子生物传感相结合，建立了一种稳健、安全且可扩展的方法，可实现快速、可靠的 BA 检测和定量，在即时诊断和分散毒素监测方面具有强大的潜力。

总结

这项研究基于生物合成衍生的 BA−MBP 融合蛋白，开发了一种环保、快速、无标记的纳米光子生物传感器，用于检测尿液中的 BA。该融合蛋白是从构建的质粒中表达的可克隆的均质产物，允许以低成本进行可重复的大规模制备。基于BA-MBP融合蛋白和特异性抗体建立了icELISA和纳米光子生物传感器。 BiMW 生物传感器的 IC50 为 0.66 ng/mL，比相应的 ic-ELISA 灵敏 10 倍，并且足以根据中国立法检测食品中监管限值的 BA（银耳中的 250 μg/kg）。

该生物传感器能够可靠、准确地对 BA 进行定量，正如盲样所证明的那样，快速获得结果的时间为 20 分钟，无需任何样品预处理，只需简单稀释。根据中毒患者的报告值，灵敏度完全符合临床需要。结果显示与 LC-MS/MS 测量值具有很强的相关性，证实了生物传感器平台的可靠性。与其他检测方法相比，基于 BA−MBP 的 BiMW 生物传感器表现出与快速免疫层析测试相当的更高的灵敏度和性能，同时利用直接表达的缀合物，消除了额外的化学偶联步骤。总体而言，该方法为 BA 中毒的早期诊断提供了一个可重复、经济高效且快速的护理点平台。

来源：https://doi.org/10.1021/acs.analchem.6c01567

来源：生物传感器