电泳技术

好的，电泳技术是一种利用带电粒子（分子或颗粒）在电场中向着与其所带电荷相反电极方向移动的速度不同，从而对混合物进行分离、分析和鉴定的技术。

它的核心原理基于以下几点：

电荷： 待分离的分子（如蛋白质、DNA、RNA等）在特定的溶液环境中会带有净的正电荷或负电荷。电荷的来源可以是分子本身的基团电离（如蛋白质的氨基和羧基），也可以是在电泳缓冲液中的状态（如DNA在常规缓冲液中带负电）。
电场： 在电泳装置的两端施加直流电压，形成一个稳定的电场。
迁移： 带电分子在电场力的驱动下，会向与其所带电荷极性相反的电极方向迁移（带负电的分子向阳极移动，带正电的分子向阴极移动）。
分离基础： 混合物中不同分子迁移的速度（迁移率） 不同。影响迁移速度的关键因素包括：
- 电荷量： 所带净电荷越多，受到的电场力越大，迁移越快。
- 分子大小与形状： 在自由溶液中，小分子受到的阻力小，迁移快；大分子受到的阻力大，迁移慢。形状也会影响流体阻力。
- 电场强度： 电压越高，电场越强，分子迁移越快。
- 介质（凝胶/溶液）的性质： 这是最常用的分离机制。
  - 凝胶电泳： 最常用。将待测样品加入多孔介质（如琼脂糖凝胶或聚丙烯酰胺凝胶）中。凝胶像一个分子筛，大分子在孔隙中移动困难，迁移慢；小分子移动容易，迁移快。这样，分子不仅根据电荷，更主要地是根据其大小（分子量） 得到分离。凝胶浓度越高，孔径越小，分离小分子的分辨率越高。
  - 自由溶液电泳： 如毛细管电泳（CE），分离主要基于分子的荷质比（电荷/质量比）。

电泳技术的主要类型和应用：

琼脂糖凝胶电泳：
- 介质： 琼脂糖凝胶（孔径较大）。
- 主要应用： 分离、鉴定和纯化DNA和RNA片段（如PCR产物、酶切产物）。常用于分子生物学实验（如克隆、Southern/Northern blotting）、DNA指纹图谱分析、亲子鉴定、病原体检测等。可以依据DNA标准分子量Marker估计未知片段的大小。
聚丙烯酰胺凝胶电泳：
- 介质： 聚丙烯酰胺凝胶（PAGE，孔径较小且可精确调控）。
- 主要应用：
  - 非变性PAGE： 分离蛋白质时保持其天然结构和活性，分离基于电荷、大小和形状。
  - 变性SDS-PAGE： 最常用。加入阴离子表面活性剂十二烷基硫酸钠（SDS） 和还原剂（如巯基乙醇）。SDS使蛋白质变性并带上大量负电荷，屏蔽了蛋白质原有的电荷差异；还原剂破坏二硫键。这样，蛋白质的迁移率几乎只取决于其分子量。是蛋白质组学、生物化学中分离、鉴定蛋白质、测定蛋白质分子量的金标准技术。常作为Western Blotting（免疫印迹）的第一步。
  - DNA测序： 高分辨率的PAGE用于经典的桑格法DNA测序。
等电聚焦：
- 原理： 在凝胶中建立一个稳定的pH梯度。蛋白质在电场中迁移，当迁移到其等电点（pI，净电荷为零）的pH位置时，电荷为零，停止迁移。从而实现高分辨率地分离不同等电点的蛋白质。
- 应用： 主要用于蛋白质分析，特别是二维电泳（2D-PAGE）的第一维。
二维电泳：
- 原理： 结合了等电聚焦（第一维，按pI分离）和SDS-PAGE（第二维，按分子量分离）。
- 应用： 复杂蛋白质混合物（如全细胞裂解液）的高分辨率分离和分析，是蛋白质组学研究的核心技术之一。
毛细管电泳：
- 介质： 在细长的毛细管（内径通常25-100微米）中填充缓冲液或凝胶。
- 原理： 高电场强度下，在自由溶液或稀凝胶中进行高效快速分离。分离基于荷质比（电荷/大小）。检测器（如紫外、荧光）直接安装在毛细管末端。
- 应用： 高效、快速、自动化、样品用量少。广泛应用于DNA测序（现代高通量测序仪的基础）、片段分析、蛋白质分析、小分子离子和药物分析、手性拆分等。
免疫电泳：
- 原理： 将电泳分离（通常是琼脂糖凝胶）与免疫沉淀反应相结合。
- 应用： 用于检测和分析血清或体液中的特定抗原（如免疫球蛋白、补体成分），辅助疾病诊断（如多发性骨髓瘤）。

电泳过程简述：

制胶： 根据分离对象选择合适的凝胶类型（琼脂糖或聚丙烯酰胺）和浓度，制备凝胶板。
加样： 将待测样品与加样缓冲液（含指示染料和增加密度的物质）混合，用微量移液器加入凝胶上的加样孔中。
电泳： 将凝胶放入装有缓冲液的电泳槽中，连接电源，施加合适的电压（通常几十到几百伏）。
迁移： 带电分子在电场作用下向相应电极移动。指示染料（如溴酚蓝）随前沿移动，指示电泳进程。
终止与染色： 当指示染料迁移到接近凝胶末端时，停止电泳。取出凝胶进行染色（如核酸用溴化乙锭EB或更安全的替代染料，蛋白质用考马斯亮蓝或银染）或转膜（如用于Western Blotting）。
检测与分析： 在紫外灯下观察核酸条带或用成像系统拍摄记录。对于蛋白质染色胶，用成像系统拍摄分析条带的位置、大小和强度。通过与已知分子量标准（Marker）比较，可以估算未知分子的分子量或分析其组成。

总结来说，电泳技术是生物化学、分子生物学、遗传学、医学诊断、法医学等领域不可或缺的基础实验技术，它利用电场驱动和介质筛分效应，高效、简便地实现了对带电生物大分子（尤其是核酸和蛋白质）的分离、分析和鉴定。